РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Матеріали
Всі дослідження були виконані з використанням похідних 1,4-бенздіазепіну:
циназепам, норциназепам (3-гідроксіфеназепам), а також їх мічені радіоактивними
елементами 14С – циназепам та 14С-норциназепам з питомою активністю 0,27 та
0,28 Ки/моль відповідно.
Методи синтеза, докази хімічної будови сполук фізико-хімічними методами (УФ-,
ІЧ-спектроскопії, мас-спектрометрії тощо) були викладені в розділі 1.1.
У ході науково-дослідних робіт були використані: 1,2-пропіленгліколь (чда,
Merk, Німечина), полівініловий спирт (чда, «Sigma», М=70000 - 100000), Тритон
Х-100 (чда, Merk, Німечина), Твін-80 (чда, Merk Німечина), b-глюкуронідаза
(чда, Merk, Німечина), 1,5-пентаметілентетразол (коразол, Acros, USA),
бікукулін (Acros, USA), мурашина кислота (чда, Merk, Німечина), оцтова кислота
(чда, Merk, Німечина), хлороформ (чда, Укрхімекспо, Київ), етанол (чда), гексан
(чда, ТУ 6-09-06-657-75), чьотирьоххлористий вуглець (ГОСТ 202088-74), ацетон
(чда, Merk, Німечина), 2,5-діфенілоксазол (РРО) (чда, Merk, Німечина),
1,4-біс-2-(5-феніл)-оксазолілбензол (РОРОР) (чда, Merk, Німечина), рідинна
сцинтиляційна суміш (Canberra Packard).
Прилади.
Сцинтиляційний фотометр - TRІ-CARB 2700 (Canberra PACKARD, США), ваги
лабораторні ВЛР-200, центрифуга лабораторна медична ОПн-8, іономер ЭВ-74,
термостат ТПС.
Досліди були проведені на нелінійних мишах масою 18-25 г та щурах лінії
„Vistar” вагою 180-220 г.
Експериментальні тварини утримувалися на повноцінній лабораторній дієті при
природному світловому циклі. Досліджувані водорозчинні сполуки вводили
ізотонічному розчині NaCl, ліпофільні – у твіновій суспензії. Були використані
внутрішньоочеревинний, внутришньосудинний, трансдермальний способи введення
речовин експериментальним тваринам.
Похідні 1,4-бенздіазепіну вводилися в дозах 0,085-28 мг/кг. Вибір доз цих
препаратів обумовлений раніше проведеними дослідженнями їх протисудомної
активності як при внутрішньосудинний інфузії зворотних агоністів
ГАМК-медіаторної системи, так і на моделі осередкової епілепсії, викликаної
аплікацією бікукуліну, коразолу, пікротоксину, пеніциліну [10,
[lxxxii]-[lxxxiii], [lxxxiv]], що дає можливість провести порівняльний аналіз
дії проліків і ліків при різних умовах, що моделюють гальмівні медіаторні
системи. Контрольним тваринам уводилися відповідні об’єми фізіологічного
розчину або твінової суспензії.
2.2. Методи дослідження
В роботі були використані різні фізико-хімічні методи, що визначали якість
досліджуваних сполук та дозволяли провести валідацію належним чином відповідних
статистичних процедур.
2.2.1. Визначення питомої радіоактивності та радіохроматографічної чистоти
циназепаму та норциназепаму
Для визначення радіохроматографічної чистоти 2-14С циназепаму та
2-14С норциназепаму методом ТШХ [[lxxxv]]. Готували розчин з концентрацію 100
мкг речовини в 1 см3 спирту (0,001 %). Для цього 10,0 мг речовини розчиняли в
спирті та доводили до об`єму 100 см3. Певні об`єми (0,1-1,0 см3) цього розчину
наносили на хроматографічну пластину “Silufol – 254” та хроматографували
попередньо в чотирьохлористому вуглецю, до нижнього краю пластини, та в системі
гексан : ацетон (2:1) (у випадку норциназепаму – у системі хлороформ : гексан :
ацетон (2:3:2), від старту до верхнього краю пластини. В якості „свідка”
використовували нерадіоактивні сполуки циназепаму та норциназепаму. Після
хроматографічного розділення пластину розрізали на зони розміром 0,1 – 0,05 Rf,
заливали толуольно-спиртовим сцинтилятором (10 мл) та визначали зміст
радіоактивності у кожній пробі. Питому радіоактивність препарату (в Ки/моль)
визначали за формулою:
де ПР(Ки) – питома радіоактивність (Ки/моль); a – активність зразка (імп/хв); m
– маса внесеного образку, (мкг); M - молярна маса циназепаму (465,68
мкг/мкмоль) чи норциназепаму (365,61 мкг/мкмоль), 2,22*106 – активність 1
мкКи.
Питому активність зразку в Бк визначали за формулою:
де ПР(Бк) – питома радіоактивність (Бк/моль); a – активність зразка, (імп/хв);
m – маса внесеного образку, (мкг); M - молярна маса циназепаму (465,68
мкг/мкмоль) чи норциназепаму (365,61 мкг/мкмоль).
2.2.2. Екстракція циназепаму та його метаболітів з біологічного матеріалу
У пробу добової сечі чи гомогенату органу (1:5) об’ємом 2 см3 додавали 0,05 см3
розчину циназепаму та його метаболіту - норциназепаму (концентрація кожної із
сполук – 0,33 мг/см3) [[lxxxvi]]. Потім у пробу додавали 0,1 см3 розчину
карбонатного буферу (до рН 8-9) та екстрагували 4 рази (по 5 см3 хлороформу),
центрифугуючи 5 хв при 5000 об/хв. Отримані послідовні екстракти (органічна
фаза) випарювали насухо та розчиняли у 10 см3 толуольно-спиртового сцинтилятору
та визначали сумарний вміст радіоактивних продуктів у пробі на
рідинно-сцинтиляційному фотометрі. Потім у водну фазу досліджуваної проби після
екстракції додавали 0,1 см3 розчину ацетатного буферу (до рН 3-4), екстрагували
хлороформом (4 рази по 5 см3). Отримані послідовні екстракти (органічна фаза)
випарювали насухо та розчиняли у 10 см3 толуольно-спиртового сцинтилятору та
визначали сумарний вміст радіоактивних продуктів у пробі. Для хроматографічного
розподілу екстрактів на пластинку для тонкошарової хроматографії наносили
отриманий хлороформний екстракт (у вигляді смуги), та хроматографували у
системі розчинників гексан : ацетон (2:1) 4-6 разів, використовуючи
нерадіоактивні сполуки циназепаму та норциназепаму у якості „свідків”.
Візуальний контроль хроматограм здійснювали за допомогою УФ-випромінювача
„Хроматоскоп-254”. Потім визначали радіо
- Київ+380960830922