РОЗДІЛ 2
матеріали та методи дослідження
Дослідження були проведені на щурах – самцях лінії Вістар-Кіото вагою 180-220г.
Щури отримували стандартний раціон харчування віварію. Були дотримані всі
вимоги щодо роботи з експериментальними тваринами. Забій здійснювали в стані
глибокого уретанового наркозу (2 г/кг).
Для моделювання цукрового діабету щурам віком 4 міс та вагою 180 – 200 г
вводили внутрішньоочеревинно стрептозотоцин (Sigma, США) з розрахунку 50 мг/кг
однократно. Для дослідів використовували тварин через 10 – 12 тиж після
ін’єкції. Контроль вмісту глюкози крові здійснювали за допомогою глюкометра
“Медісенс” (“Abbott”, США).
2.1. Дослідження судинних реакцій.
Для реєстрації скорочувальної активності судинних препаратів використовували
установку [13], що включає в себе перфузійну комірку, механоелектричний
перетворювач 6МХ1С, температурний датчик, нагрівальні елементи, розподільні
крани та герметично закриті зверху лійки Лібіха для подачі тестуючих розчинів
для перфузії (рис. 2.1). Автоматична система стабілізації температури дає
можливість підтримання температури перфузуючого розчину ± 0,2°С в діапазоні +35
- +37°С при робочому об’ємі камери 12 дм3. Електричний сигнал з виходу
механоелектричного перетворювача реєстрували за допомогою реєструючого пристрою
КСП-4.
Судинні препарати розташовували в термостатованій перфузійній комірці з хімічно
неактивного плексигласу об’ємом 1,0 мл, що знаходиться всередині камери. В
комірці препарат кріпився в горизонтальному положенні до двох гачків.
Рис. 2.1. Схема установки для реєстрації скорочувальної активності ізольованих
судинних препаратів
1 – термостатована камера
2 – лійки для подачі розчинів
3 – розподільний кран
4 – механоелектричний перетворювач 6МХ1С
5 – температурний датчик
6 – нагрівальні елементи
7 – фіксатор
8 – навантаження
9 – робоча комірка
10 – препарат.
Від гачків відходять нитки таким чином, що один з них сполучений з
механоелектричним перетворювачем, а другий кріпиться через блок до вантажу, за
допомогою якого розтягується смужка. Комірку перфузували з швидкістю 2 – 3
мл/хв Дослідження проводили на судинних препаратах грудного відділу аорти та
ворітної вени щурів.
2.1.1. Дослідження ендотелійзалежних та ендотелійнезалежних судинних реакцій.
Після розтину грудної порожнини виділяли аорту та переносили її в чашку Петрі,
заповнену розчином Кребса. В розчині судину препарували, видаляючи сполучно -
тканинну оболонку та жирову тканину. Відпрепаровану аорту нарізали на сегменти
шириною 1,5 - 2 мм і масою 2 - 2,5 мг з урахуванням циркулярної орієнтації
гладеньком’язового шару. Кільцевий препарат для дослідження поміщали в проточну
термостатовану (36 - 36,5° С) камеру об’ємом 1 см 3, у якій препарат піддавали
пасивному розтягненню силою 8 - 10 мН і витримували протягом 20 - 40 хв у
модифікованому розчині Кребса такого складу (ммоль/л): NaCl – 133,0, KCl – 4,7,
NaHCO3 – 16,3, NaH2PO4 – 1,38, CaCl2 – 2,5, MgCl2 –1,05, глюкоза - 7,8, pH
7,4.
Скорочувальну активність аорти реєстрували в режимі, наближеному до
ізометричного, за допомогою механоелектричного перетворювача 6МХ1С. Активації
гладеньких м'язів досягали додаванням до буферного розчину норадреналіну
(“Sigma”, США) у концентрації 10-5 моль/л. Для дослідження ендотелійзалежного
розслаблення судинного препарату реєстрували зміни тонічної напруги гладеньких
м'язів на агоніст мускаринових рецепторів ацетилхоліну гідрохлорид (“Fluka”,
Швеція) у концентрації 10-6 моль/л. Для дослідження ендотелійнезалежного
розслаблення судинного препарату реєстрували зміни тонічної напруги гладеньких
м'язів на донор NO нітропрусид натрію (“Sigma”, США) у концентрації 10-4
моль/л. Рівень скорочення гладеньких м'язів на норадреналін приймали за 100 %.
Амплітуду зміни тонічної напруги судинного препарату при додаванні до розчину
ацетилхоліну або нітропрусиду розраховували у відсотках від рівня їхнього
стійкого скорочення (“плато”).
2.1.2. Дослідження скорочувальних реакцій та жорсткості судинних гладеньких
м’язів під впливом дозованого розтягування.
Після розтину черевної порожнини виділяли ворітну вену від воріт печінки до
місця її переходу в мезентеріальну вену та швидко переносили в чашку Петрі,
заповнену розчином Кребса. В розчині судину препарували, видаляючи сполучно -
тканинну оболонку та жирову тканину. Відпрепаровану судину розрізали на
поздовжні смужки довжиною 2 - 3,5 мм, шириною 1 - 1,5 мм та масою 1 - 2 мг.
Судинні смужки ворітної вени розміщували в проточній термостатованій (36 -
36,5° С) камері об’ємом 1 мл3, в якій препарат піддавали пасивному розтягуванню
силою 2 мН і витримували протягом 30-60 хвилин у модифікованому розчині Кребса.
Скорочувальну активність судинних гладеньких мўязів реєстрували за допомогою
механоелектричного перетворювача 6МХ1С у режимі, який був близький до
ізометричного. Смужки дозовано розтягували до 8 - 14 мН та реєстрували зміну
амплітуди фазних скорочень для отримання змін залежності довжина-сила
гладеньких мўязів судин.
За допомогою мікроскопа МБС-10, який кріпився зовні камери на штанзі та
окулярного гвинтового мікрометра МОВ-1-15ґ вимірювали довжину судинного
препарату ворітної вени. Основні показники мікрометру: збільшення окуляру -
15ґ; межі вимірювання от 0 до 8 мм; вартість ділення - 0,01 мм. Довжину
судинної смужки (Х) визначали за формулою Х = (II - I)/b, де (II - I) – різниця
ділень за шкалою окулярного мікрометра; b – лінійне збільшення об’єкту.
Розраховували: відносний приріст активної сили скорочень - DL/Lo та жорсткість
смужки, що представляє собою відношення приросту активної сили скорочень до
зміни довжини судинного препарату у
- Київ+380960830922