РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Вибір і умови утримання експериментальних тварин
Дослідження виконано на 236 нелінійних щурах-самцях з вихідною масою 220±30 г.
Контрольні групи були сформовані з 40 інтактних щурів (по 8 тварин у кожній
групі), схожих за віком, статтю і станом адренореактивності організму. Усіх
тварин до і після відтворення моделі опіку шкіри утримували в умовах віварію на
стандартному раціоні зі стабільним вмістом натрію і при вільному доступі до
води. Підготовку тварин до експериментів, всі інвазивні втручання, знеболювання
і виведення з експерименту здійснювали з дотриманням відповідних вимог
Європейської Конвенції по захисту хребетних тварин. Тварин виводили з
експерименту між 9.00 і 10.00 годинами у спеціальному приміщенні при
температурі 18-22°С, відносній вологості 40-60% і освітленості 250 люкс через
1, 3 і 6 місяців після моделювання термічної травми шкіри. Протоколи
експериментів ухвалені комісією з біоетики Донецького державного медичного
університету ім. М.Горького.
2.2. Характеристика груп експериментальних тварин
Моделювання опіку шкіри проводили під анестезією (внутрішньом'язова ін'єкція 1%
розчину гексеналу в дозі 10 мг/кг маси тіла). Попередньо на спині маркером
обмежували зону, яка відповідала 20-25% від загальної поверхні тіла,
розраховану планіметричним методом за допомогою прозорої сітки. Потім до
обраної ділянки шкіри на 10 сек прикладали алюмінієвий циліндр, нагрітий до
100°С [200], у результаті чого відтворювали опік шкіри, що відповідав ІІІА-ІІІВ
ступеню відповідно до загальноприйнятої клінічної класифікації [37].
На підставі дослідження хемосенситивності b2-адренорецепторів тромбоцитів (IС50
ізадрину – інгібуюча концентрація ізадрину, що знижує агрегацію тромбоцитів in
vitro на 50%), значень ЕС50 ФАТ (ефективна концентрація ФАТ, що підвищує
агрегацію тромбоцитів in vitro на 50%) і резервної потужності ЦОГ і ЛОГ
експериментальних тварин розподілили на три експериментальні групи (1-а –
нормоадренореактивні, 2-а – гіпоадренореактивні та 3-я – гіперадренореактивні)
та підгрупи (табл. 2.1).
Таблиця 2.1
Характеристика експериментальних тварин
Групи
Підгрупи
IС50 ізадрину,
мкМ до опіку шкіри
ЕС50 ФАТ,
мкМ,
через 1 міс
Резервна потужність ферментів метаболізму АК, %
ЦОГ
ЛОГ
1-а (n=26)
26,4±0,64
1,36±0,06
33,3±1,3
34,2±1,4
2-а (n=81)
2А (n=25)
2.1Б (n=32)
2.2Б (n=24)
31,1±0,71***
37,2±0,81***
37,2±0,81***
1,15±0,04**
1,76±0,07***
1,76±0,07***
32,2±1,3
16,7±0,6
16,7±0,6
29,7±1,2
1,5±0,05···
1,5±0,05···
3-я (n=129)
3.1А (n=38)
3.2А (n=30)
3.1Б (n=33)
3.2Б (n=28)
20,10±0,61**
20,10±0,61**
23,3±0,72***
23,3±0,72***
3,09±0,11***
3,09±0,11***
3,59±0,13***
3,59±0,13***
1,9±0,11
1,9±0,11
23,0±0,8
23,0±0,8
63,7±2,7···
63,7±2,7···
61,9±2,5···
61,9±2,5···
Примітка. *, **, *** – p<0,05, 0,01, 0,001 у порівнянні з 1-ю групою; ··· –
p<0,001 у порівнянні з ЦОГ.
З метою корекції порушень метаболізму АК тваринам протягом трьох тижнів
(починаючи з 32-го дня після моделювання опікової травми) внутрішньом'язово
вводили: у підгрупі 2.2Б – інгібітор ЦОГ (диклофенак натрію по 100 мг/кг маси
тіла в день); у підгрупі 3.2А – блокатор ЛОГ (зілеутон по 50 мг/кг маси в день)
і простагландин Е2 (простенон по 100 мкг/кг в день), у підгрупі 3.2Б призначали
тільки зілеутон (50 мг/кг маси в день). Функціональні та морфологічні
дослідження нирок щурів даних підгруп проводили через 1 міс після завершення
фармакологічної корекції, що відповідало терміну 3 міс після термічної травми.
Із 236 тварин у віддалений термін (1-6 місяців) після термічної травми загинуло
23 щура. Летальність у 1-й групі склала 7,7%, у 2-й – 7,4% (у підгрупі 2А – 4%
і в підгрупі 2.1Б – 15,6%) і в 3-й групі – 11,6% (у підгрупі 3.1А – 21%;
підгрупі 3.2А – 10%; підгрупі 3.1Б – 9,1% і підгрупі 3.2Б – 3,6%). Відповідно
до цілі й задач даної роботи 213 експериментальних щурів, що вижили,
розподілили таким чином: 1-а група – 24 тварини; 2-а група – 75 щурів (підгрупа
2А – 24, підгрупа 2.1Б – 27 і підгрупа 2.2Б – 24 щура); 3-я група – 114 щурів
(підгрупа 3.1А – 30, підгрупа 3.2А – 27, підгрупа 3.1Б – 30 і підгрупа 3.2Б –
27 щурів).
2.3. Аналіз хемосенситивності b2-адренорецепторів і ФАТ-рецепторів тромбоцитів
in vitro
Оцінку адренореактивності організму проводили на підставі хемосенситивності
b2-адренорецепторів тромбоцитів. Для виділення тромбоцитів з вени брали кров у
пластикові пробірки, що містили кислий цитратдекстрозний антикоагулянт у
співвідношенні його і крові 1:6. Кров центрифугували протягом 15 хвилин при 200
g для одержання збагаченої на тромбоцити плазми. Після видалення плазми
проводили подальше центрифугування протягом 10 хвилин при 2000 g з метою
одержання плазми, збідненої на тромбоцити, яку використовували для підтримки
стандартної кількості клітин на рівні 300 тис/мкл. Відмиті тромбоцити
суспензували в буферному розчині наступного складу (мкМ): NaCl (138), KCl (3),
MgCl2 (1), глюкоза (10), HEPES (10), Na2PO4 (0,37), p 7,4.
Для вивчення модулюючого ефекту ліганду b2-адренорецепторів на функціональну
відповідь тромбоцитів, що проявляється дезагрегацією тромбоцитів, до суспензії
вводили 5 мкМ АДФ (фірма "Reanal", Угорщина) і через 2 хвилини додавали дозу
ізадрину (ізопропілнорадреналіну). Інкубацію продовжували 8 хвилин при 37°° С й
перемішуванні зі швидкістю 1000 об/хв. АДФ та ізадрин додавали в інкубаційний
розчин у вигляді концентрованих розчинів по 5-15 мкл. Таким чином, кінцеві
концентрації індукторів у пробі складали 0,5-5 мкМ для АДФ і 1-100 мкМ для
ізадрину. Оцінювали дозозалежний напрямок зсуву і амплітуду змін
адренореактивності тромбоцитів, вик
- Київ+380960830922