Структурно-функціональна організація політенних хромосом Drosophila melanogaster Meig. у зв’язку з ефектом гетерозису, ізогенізацією та впливом щільності культури

<p>ГЛАВА 2<br />ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ<br />2.1. Объект исследования<br />Исследования выполнены на классическом объекте генетических исследований –<br />плодовой мушке Drosophila melanogaster Meig., на линиях из коллекции кафедры<br />генетики и цитологии Харьковского национального университета им. В. Н.<br />Каразина. <br />В работе использовали инбредные линии дикого типа разного географического<br />происхождения: Oregon-R (Or) и Canton-S (C-S). Инбридинг поддерживался путем<br />скрещиваний сибсов. Линию Oregon-R (Or) исследовали на разных стадиях<br />инбридинга – от 56 до 116 поколений. Линия Canton-S (C-S) в разных опытах имела<br />степени инбридинга от 58 до 118 поколений. <br />Для изучения гетерозисного эффекта при разных степенях инбридинга линий<br />Oregon-R (Or) и Canton-S (C-S) были получены реципрокные гибриды первого<br />поколения между ними: C-S Ч Or, Or Ч C-S. <br />В работе использовали также аутбредную мутантную линию Bar, линию BarC-S,<br />полученную путем восьми насыщающих скрещиваний мух неселектируемой аутбредной<br />линии Bar с мухами аутбредной линии Canton-S (C-S), а так же линию isoII;<br />isoIII BarC-S, изогеную по хромосомам 2, 3. Мутация Bar (B) (1 – 57,0) является<br />тандемной дупликацией 16A1 – 16A7 области, что фенотипически проявляется в<br />редукции глаз до узкой вертикальной полосы с количеством фасеток около 90 у<br />самцов и 70 у самок, в отличие от нормального количества около 740 и 780<br />фасеток для самцов и самок, соответственно [187]. <br />В разных опытах объектами исследования были личинки, 0-часовые предкуколки и<br />имаго D. melanogaster. <br />2.2. Методы исследования<br />Мух выращивали на стандартной сахарно-дрожжевой среде при температуре 24±0,5°C<br />в термостате. Культуры дрозофилы развивались в сахарных стаканчиках диаметром<br />2,0 см и высотой 10,0 см. Объем питательной среды в каждом стаканчике составлял<br />5,0 мл. Плотность культуры задавали количеством пар родительских особей на один<br />стаканчик: 1 пара (контроль) и 3, 5, 7 пар (опыт). Изогенизацию хромосом<br />проводили согласно классической схеме c использованием линии-балансера<br />Cy/Pm;D/Sb (рис. 2.1) [122]. <br /><br />Рис. 2.1. Схема выведения изогенных линий<br />У инбредных линий и межлинейных гибридов F1 в условиях различной плотности<br />культуры, а так же в линиях BarC-S и isoII; isoIII BarC-S исследовали<br />показатели адаптивной ценности: выход имаго, массу тела имаго,<br />теплоустойчивость особей, яйцепродукцию, частоту возникновения доминантних<br />летальних мутаций. <br />Для выяснения механизмов действия перенаселенности культуры, изогенизации<br />хромосом, эффекта гетерозиса и дифференциальной устойчивости генотипов изучали<br />особенности структуры и функциональной активности политенных хромосом слюнных<br />желез, в частности, пуфовой активности, степени политении, гомологичной и<br />негомологичной конъюгации гигантских хромосом у инбредных линий и гибридов F1<br />дрозофилы в условиях разной плотности культуры и при изогенизации хромосом. <br />Исследовали также влияние плотности культуры и изогенизации хромосом на частоту<br />неравного кроссинговера в локусе Bar, экспрессивность признака Bar в линиях<br />Bar, BarC-S, isoII; isoIII BarC-S D. melanogaster. <br />В работе использовали как традиционные методы, так и ориги­нальные методики,<br />разработанные на кафедре генетики и цитологии Харьковского национального<br />университета им. В. Н. Каразина. <br />2.2.1.Определение степени политении гигантских хромосом в слюнных железах<br />дрозофилы. Степень политении хромосом исследовали на давленых ацетоорсеиновых<br />препаратах слюнных желез дрозофилы [88]. Для приготовления препаратов<br />использовали личинок конца третьего возраста. По данным Родмана, инициация<br />новых циклов эндоредупликации политенных хромосом прекращается за несколько<br />часов до личиночно-предкуколочной линьки, и хромосомы к этому времени достигают<br />степеней политении 256C, 512C, 1024C и 2048C [210]. Слюнные железы личинок<br />выделяли в фи­зиологическом растворе Эфрусси-Бидла под микроскопом МБС-I.<br />За­тем их очищали от жирового тела, фиксировали и окрашивали в течение<br />нескольких часов в 2 % растворе ацетоорсеина, приготовленном на основе 45 %<br />уксусной кисло­ты. После окрашивания слюнные железы переносили на предметное<br />стекло в каплю из смеси 80 % молочной и 45 % уксусной кислот в соотношении 1:1<br />и раздавливали с помощью пок­ровного стекла. Приготовленные таким образом<br />препараты анализи­ровали с помощью светового микроскопа “Studar-E” при<br />увеличении Ч 600. <br />Отличия по степени политении хромосом определяли цитоморфометрическим методом<br />[114]. На цитологических препаратах хромосомы с разной степенью политении<br />отличаются по ширине и интенсивности их ок­рашивания ацетоорсеином (рис. 2.2,<br />2.3). Измерения ширины хромосом проводили с помощью окуляр-микрометра в районе<br />диска 22А хромосомы 2L, который примерно соответствует средней ширине<br />хромосом. <br />При исследовании влияния плотности культуры на степень политении инбредных<br />линий Or, C-S и гибридов F1 C-S Ч Or, Or Ч C-S дрозофилы самок и самцов<br />исследовали отдельно, по 15 – 18 личинок линий и гибридов F1 в каждом варианте<br />эксперимента. Всего было исследовано 243 особи. <br />При исследовании влияния изогенизации хромосом 2 и 3 в линиях BarC-S и<br />isoII; isoIII BarC-S исследовали по 10 – 11 личинок в каждом варианте<br />эксперимента, отдельно самок и самцов. Всего исследована 41 особь. <br />2.2.2. Оценка пуфовой активности политенных хромосом в слюнных железах<br />дрозофилы. Пуфинг политенных хромосом исследовали на давленых ацетоорсеиновых<br />препаратах слюнных желез [88] при увеличении микроскопа Ч 600. Исследования<br />проводили на самках дрозофилы на стадии 0-часовой предкуколки. Эта стадия легко<br />оп­ределяется морфологически по выво</p>