РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Матеріал дослідження та експериментальні умови
Дослідження проведено на 274 білих щурах-самцях масою 210-220 г, яких утримували в умовах віварію. Інтактну групу склали 10 тварин. Експериментальних тварин були поділено на групи для двох серій.
У 1 серії (табл. 2.1) було використано 128 тварин, яких піддавали травматичній дії за Кеноном у модифікації Ю.М. Штихно і співавт. [147]. У цій серії через 3, 12, 24 і 48 годин після травми тварин декапітували під ефірним наркозом і визначали вміст загального та іонізованого кальцію, циклічних нуклеотидів, гормонів і стан системної гемодинаміки.
Таблиця 2.1
Кількість експериментальних тварин
СеріяНазва серіїКількість тваринконтрольекспериментІнтактні10-Серія 1Дослідження вмісту кальцію, кальційрегулюючих гормонів, стану гіпофізарно-тиреоїдної системи, циклічних нуклеотидів, системної гемодинаміки40128Серія 2Дослідження вмісту кальцію, системної гемодинаміки, летальності1086Разом:274
Контрольну групу для першої серії склали 40 тварин, яких піддавали тим же заходам, за винятком нанесення травми.
У 2 серії (табл. 2.1) на 86 тваринах було вивчено летальність, стан системної гемодинаміки та рівень іонізованого кальцію в сироватці крові. Контрольну групу для 2 серії склали 10 тварин.
Всі тварини до і після експериментальної дії перебували в стандартних умовах віварію на стандартному раціоні при вільному доступі до води та їжі при температурі 19-22°С, відносній вологості 40-60% і освітленості 250 люкс. Травматичну дію завжди завдавали о 8-9 годині ранку, у спеціально обладнаному приміщенні (маніпуляційній). Підготовка тварин до експериментів, травматична дія, інвазивні втручання й виведення з експерименту здійснювалися згідно з вимогами Міжнародних принципів Європейської конвенції (Страсбург, 1985), ухвалою Першого національного конгресу з біоетики (Київ, 2000) та узгодженням з комісією з питань біоетики ДонДМУ.
2.2. Методика відтворення стандартної дозованої травми
За 2 тижні до дослідження, згідно з рекомендаціями [68], із загальної кількості тварин віварію відбирали щурів-самців масою 210-220 г, в яких не було видимих відхилень, пухлин, пошкоджень. Тварин витримували на стандартному раціоні при вільному доступі до їжі й води, відзначали поведінкові реакції, привчали до світлового режиму (12 годин "день", 12 годин "ніч").
У день проведення експерименту тварин поодинці в індивідуальних клітках переводили в спеціальне приміщення (маніпуляційну) і піддавали ефірному наркозу через спеціальні маски з тампоном, змоченим ефіром [68]. Введення тварини в ефірний наркоз супроводжувалося зниженням рефлексів і порогу больової чутливості, звуженням зіниць, загальмованістю, а потім відсутністю рухових реакцій, уповільненням дихання. Ця реакція тривала у тварин контрольної групи до 10-15 хвилин, після чого протягом 30 хвилин відновлювалися рухові реакції, рефлекси, реакції на світло та звук. Тварин контрольної групи по черзі підносили до електромеханічного пристрою для травмування (рис. 2.1), витримували 30 сек., але не травмували.
Рис. 2.1. Електромеханічний пристрій для відтворення стандартної травми стегна за Кеноном у модифікації Ю.М. Штихно і співавт. [128]
Примітки: 1 - металева опорна підставка;
2 - електромагніт;
3 - відбійник;
4 - педальний вмикач.
Тварин експериментальних груп травмували, після чого вміщували в підготовлені стандартні клітки з вільним доступом до води та їжі. Моделювання травми здійснювали за допомогою електромеханічного пристрою (рис. 2.1). Тваринам наносили по 15 стандартних ударів електромеханічним молотком силою 250 Н/см2 спочатку по лівій, а потім по правій нижнім кінцівкам в ділянці стегна. Загальна тривалість травми складала 25-30 сек. Під час травмування уникали відкритих переломів і зовнішніх кровотеч, добиваючись лише розтрощування м'яких тканин стегна. Тварин, у яких не вдалося уникнути зазначених явищ, виключали з експерименту.
При такій експериментальній моделі летальність через 48 годин після травми складала 56%. Вказана модель відтворення механічної травми є найбільш прийнятою у зв'язку з можливістю чіткого дозування травми та забезпечення таким чином стандартності травмуючої дії. Це досягалося завдяки стандартній силі удару та тривалості травматичної дії. Після травмування тварин вміщували у звичні для них умови.
2.3. Біохімічні, радіоімунологічні та імуноферментні дослідження
Через 3, 12, 24 і 48 годин після травми 128 тварин 1 експериментальної групи і 40 тварин контрольної групи за вищеописаною методикою наркотизували ефіром. Кров збирали при декапітації в скляні центрифужні пробірки без консервантів.
У 86 тварин 2 експериментальної серії і 10 тварин контрольної групи в асептичних умовах виконували венепункцію хвостової вени та проводили взяття крові кількістю 0,5 мл. Пробірки негайно центрифугували 20 хв. на центрифузі з охолоджуванням "К-23" (Німеччина) при 3 тис. об/хв. і 4°С. Сироватку крові тубували в поліпропіленові пробірки типа "Епендорф", які попередньо маркірували, а, потім, зберігали при -40°С до проведення аналізу.
У сироватці крові щурів фотометричним методом з використанням набору хімічних реактивів виробництва фірми "LaChema" (Чехія, Брно) визначали вміст загального кальцію. Реєстрацію результатів виконували на спектрофотометрі "Specord 200" при довжині хвилі 550 нм. Концентрацію іонізованого кальцію визначали методом прямої потенціометрії на іономірі "Експерт-001" за допомогою кальційселективного комбінованого електрода "Іонікс 122.060".
Таблиця 2.2
Вміст загального та іонізованого кальцію в сироватці крові інтактних тварин
ПоказникОдиниці вимірюванняКількість тваринmMКальцій загальнийммоль/л100,041,46Кальцій іонізованийммоль/л100,030,63
Для зіставлення отриманих даних з наведеними в літератур