РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Вибір і умови утримання експериментальних тварин
Дослідження виконане на 200 щурах самцях лінії Вістар початковою вагою 220?15 г. Тварини до і після оперативного втручання знаходилися в умовах віварію на стандартному раціоні зі стабільним вмістом натрію та при вільному доступі до води. Тварин виводили з експерименту шляхом декапітації вранці між 9.00 і 10.00 годинами у спеціальному приміщенні при температурі 18-22С, відносній вологі 40-60% і освітленості 250 люкс через 7, 14 і 30 діб після моделювання 48-годинної односторонньої обструкції сечовода. Підготовка тварин до експериментів, усі інвазивні втручання, знеболення і виведення з досліду здійснювались з дотриманням відповідних вимог Європейської Конвенції із захисту хребетних тварин. Комісія з питань біоетики при Донецькому національному медичному університеті ім. М.Горького розглянула протоколи експериментів і прийшла до висновку, що експериментальне дослідження відповідає етичним вимогам.
2.2. Моделювання гострого порушення уродинаміки
У 180 щурів моделювали ООС в умовах гексеналового наркозу. Виконували серединну лапаротомію, виділяли з оточуючих тканин сечовий міхур і розсікали передню стінку. Використовуючи мікроскоп, знаходили устя лівого сечовода і у його просвіт проводили ангіокатетер. Кисетним швом фіксували катетер у стінці міхура, після чого розріз зашивали. Катетер проводили під шкірою, вільний кінець виводили на шию і приєднували до пластикової пробірки для збору сечі. Черевну стінку пошарово ушивали. Через дві доби після операції катетер закривали на 48 г, таким чином відтворювали гостре порушення пасажу сечі. Після цього відновлювали відток сечі з лівої нирки. Кров отримували шляхом катетеризації верхньої яремної вени [53].
Тваринам контрольної групи (n=20) в умовах гексеналового наркозу проводили серединну лапаротомію, виконували мобілізацію сечовода, після чого передню черевну стінку пошарово ушивали.
2.3. Дослідження in vitro сенситивності АТ1 рецепторів і стану внутрішньоклітинного сигнального шляху eNOS-протеїнкіназа G
Системний рівень ангіотензину II аналізували за результатами експрес-дослідження сенситивності АТ1 рецепторів in vitro. В якості клітин-мішеней використовували тромбоцити, які виділяли з крові [6]. Кров набирали у пластикову пробірку, що містила кислий цитратдекстрозний антикоагулянт у співвідношенні його з кров'ю 1:6. Після цього кров центрифугували протягом 15 хв при 200 g для одержання збагаченої тромбоцитами плазми. Після цього проводили подальше центрифугування впродовж 10 хв при 2000 g з метою одержання плазми, збідненої тромбоцитами, яку використовували для підтримання стандартної кількості клітин на рівні 200 тис/мкл. Відмиті тромбоцити суспендували у буферному розчині наступного складу (мкМ): NaCl (138), KCl (3), MgCl2 (1), глюкоза (10), HEPES (10), NaH2PO4 (0,37), pH 7,4 [4, 7].
У суспензію тромбоцитів вводили ангіотензин ІІ (АнгII), у вигляді концентрованого розчину по 5-15 мкл, таким чином, щоб остаточна концентрація індуктора агрегації у пробі складала 0,25-2 мкМ. Інкубацію продовжували протягом 8 хвилин при 37 С і перемішуванні зі швидкістю 1000 об/хв. Оцінювали дозозалежний напрямок зрушення і величину зміни агрегації тромбоцитів, використовуючи побудовану криву доза-відповідь [4]. Кожна експериментальна точка на графіках є середнім значенням для трьох незалежних вимірів. Середньоквадратична помилка вимірів не перевищувала 10% від отриманої величини. На основі проведених досліджень визначили EC50 - ефективну концентрацію агоністу, що призводить до 50% агрегації тромбоцитів.
Для підтвердження рецептор-опосередкованого механізму активації тромбоцитів, у додатковій серії досліджували ефект АнгII після попереднього введення в інкубаційну суміш Лозартану (5 мкМ) - селективного блокатора АТ1 рецепторів. Лозартан повністю відміняв агрегацію тромбоцитів, тому феномен індукованої агрегації тромбоцитів, що спостерігався, дійсно був зумовлений взаємодією агоністу з АТ1 рецепторами.
Для оцінки стану внутрішньоклітинної сигнальної системи eNOS-протеїнкіназа G використовували наступні серії досліджень in vitro. У І-й серії до суспензії тромбоцитів додавали фізіологічний розчин (1-й контроль). В II-й серії у проби з суспензією тромбоцитів вводили 0,25, 0,5, 1,0, 1,5 і
2 мкМ АнгII. В III-й серії до суспензії тромбоцитів додавали 0,1 мл АнгII у остаточній концентрації, що призводила до 50% агрегації тромбоцитів (ЕС50), діапазон якої складав 0,85-1,5 мкМ (2-й контроль). Для оцінки функціонування внутрішньоклітинної системи на ділянці NO-протеїнкіназа G використовували комбінацію агоністу, стимуляторів або інгібіторів у наступних концентраціях: АнгII - ЕС50, трифтазин (ТФЗ; інгібітор системи Са2+-кальмодулін) - 2 мкМ, L-аргінін (субстрат, що стимулює активність eNOS) - 200 мкМ; L-NAME (інгібітор eNOS) - 1 мкМ, нітропрусид натрію (НП; донатор NO, що підвищує активність гуанілатциклази - ГЦ) - 10 мкМ [4, 21], теофілін (інгібітор фосфодіестераз) - 5 мкМ. Проби інкубували при 20 С протягом 8-9 хв, перемішуючи зі швидкістю 1000 об/хв, після чого визначали ступінь зміни агрегації тромбоцитів у кожній пробі. Результати виражали у відсотках відносно 2-го контролю. У дослідженнях використані реактиви фірми "Sigma" (США).
Агрегацію і дезагрегацію тромбоцитів реєстрували модифікованим методом G. Born [7] шляхом вимірювання оптичної щільності світлового потоку, що проходить крізь суспензію клітин, на спектрофотометрі СФ-46. Принцип методу базується на зменшенні оптичної щільності суспензії тромбоцитів при зниженні їхньої вільної кількості внаслідок втягнення у агрегаційний процес. У якості індуктора агрегації використовували АнгII і за збільшенням коефіцієнту пропущення світла у пробі при постійному її перемішуванні судили про величину агрегації тромбоцитів.
2.4. Характеристика груп експериментальних тварин
Дослідження in vitro на суспензії тромбоцитів, в