РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ
Наукові дослідження виконані в 2000-2006 рр. у лабораторіях вивчення лейкозу, епізоотології і біохімії ННЦ "ІЕКВМ". Епізоотичні дослідження щодо поширення лейкозу великої рогатої худоби в Харківській області виконувались на базі Харківської обласної державної лабораторії ветеринарної медицини. Міжлабораторні комісійні випробування імуноферментної тест-системи проводили в ННЦ "ІЕКВМ".
Проби сироваток крові великої рогатої худоби отримували з неблагополучних щодо лейкозу господарств Харківської, Полтавської областей та АР Крим.
2.1 Матеріали
Для виконання поставлених завдань у роботі використовували:
1. Культури клітин:
- перещеплювана культура клітин нирки вівці, персистентно інфікована вірусом лейкозу великої рогатої худоби ( FLK+BLV);
- перещеплювана культура клітин нирки вівці (ПО).
2. Поживні середовища для культивування клітинних культур:
- Ігла;
- Середовище 199.
3. Вірус лейкозу великої рогатої худоби, отриманий шляхом культивування клітинної культури FLK+BLV.
4. Сироватки крові:
- позитивні контрольни сироватки з "Набору компонентів для діагностики лейкозу великої рогатої худоби методом РІД" виробництва ДП "Ветеринарна медицина";
- дослідні польові сироватки великої рогатої худоби;
- нативна сироватка великої рогатої худоби;
- сироватка великої рогатої худоби, оброблена ПЕГом;
- нормальна сироватка коней;
- сироватка новонароджених телят;
- сироватка плодів великої рогатої худоби;
- сироватка овець.
7. Лабораторні тварини: 10 кролів масою 3,5-4 кг породи Білий велетень.
8. Експериментальні тварини: 80 голів ВРХ, яких утримували в господарствах Харківської області.
Реактиви: а) речовини для приготування буферних розчинів: натрій фосфорнокислий двозаміщений 12-водний, натрій фосфорнокислий однозаміщений 2-водний, натрій хлористий, карбонат натрію, гідрокарбонат натрію, лимонна кислота, Тріс, HCl, ЕДТА;
б) детергенти: Тритон Х-100, Твін-20;
в) консерванти: азид натрію, мертіолят натрію;
г) носії для хроматографії: Sephadex G-25, Toyopearl 40-55 F, Chelating Sepharose;
д) інші: пероксидаза хрону, орто-фенілендіамін (ОФД), перекис водню, сірчана кислота, поліакріламід, бісакріламід, додецилсульфат натрію (ДСН), сульфат амонію, персульфат амонію, N,N,N|,N| тетраметіл-етілен-діамін (ТЕМЕД); Coomassie Blue G 250, гліцерин, етанол, поліетиленгліколь-115, сахароза, фосфорно-вольфрамова кислота, полівінілформаль, хлороформ, фотоплівка ФТ-41.
Роботу виконували з використанням такого обладнання:
горизонтальні спектрофотометри (рідери): "ИФКО-З" (СРСР), "АИФ-М/340 - Витязь" (Білорусь), "Labsystem" (Фінляндія), "Sanofi" (Франція); стаціонарні термостати; розділювальний апарат "АР-2-15" (СРСР); інвертований мікроскоп "Биолам П-1" (СРСР); імерсійний мікроскоп "PZO" (Польща); люмінесцентний мікроскоп; електронний мікроскоп "ПЕМ-125" (Україна); низькошвидкісні центрифуги "РС-6", "ЦЛС-3Т" (СРСР), "Jnetzki
S-70" (Польща), "К 24 D" (Німеччина); ультразвуковий дезінтегратор "УЗДН-А 5" (Україна); високошвидкісна центрифуга "MSE Superspeed" (Англія); абсорбціометр "LKB 2238 Uvicord S II" (Швеція); самописний потенціометр "LKB 2210" (Швеція); колектор "LKB 2070" Ultrorac I (Швеція); перистальтичний насос; набір колонок для гель-фільтрації; спектрофотометр "СФ-26" (СРСР); рефрактометр "RL-3" (Польща); ваги торзіонні "ВТ" (СРСР), аналітичні "АДВ - 200" (СРСР); рН - метр рН 121 (СРСР); програмований термостат для пробірок типу "Epеndorf" "Termo 24-15" (Росія); ампліфікатор "Amply-4" (Росія); трансілюмінатор "УВТ-1" (Росія); прилад для горизонтального електрофорезу "Biorad" (Росія); автоматичні піпетки (дозатори) змінного об'єму одноканальні та багатоканальні "Ленпипет" (Росія) та "Labsystem" (Фінляндія); побутові холодильники та морозильні камери.
2. 2 Методи
2.2.1 Методика епізоотологічних досліджень
Епізоотологічний моніторинг лейкозу ВРХ проводили з використанням епізоотологічного та статистичного методів досліджень. Користуючись звітними даними Міжнародного Епізоотичного Бюро щодо епізоотичної ситуації з лейкозу за 1999-2004 роки, Державного департаменту ветеринарної медицини МАП України за 1994-2005 роки, Харківської обласної лабораторії ветеринарної медицини за 1992-2005 роки, була визначена епізоотична ситуація з лейкозу ВРХ у світі, Україні в цілому та Харківській області зокрема.
Для оцінки епізоотичної ситуації за період досліджень відмічали кількість виявлення неблагополучних пунктів, хворих тварин, а також скільки хворих тварин було здано на забій. Використовуючи ці дані, розраховували рівень інцидентності та інфікованості худоби на лейкоз ВРХ [199, 200]. Оскільки середні значення епізоотичних коливань динаміки епізоотичного процесу не можуть бути використані, їх оцінка проводилась за лінією загального тренду, яку було побудовано шляхом виправлення найменших квадратів.
З метою вивчення динаміки коливання рівня антитіл до вірусу лейкозу у природно інфікованих тварин був проведений епізоотичний експеримент: в неблагополучному господарстві було сформовано групу корів. Від цих тварин протягом року проводили щомісячний відбір крові з наступною серологічною діагностикою.
2.2.2 Серологічні методи
Перед початком роботи щодо створення тест-системи була отримана контрольна панель сироваток, яка складалась з позитивних та негативних зразків. Ці зразки були відібрані з польових си