РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Методологічною основою виконання наукових досліджень цієї дисертаційної роботи був ретроспективний аналіз матеріалів літератури щодо ефективності існуючих методів і способів довготривалого зберігання бактерій, впливу середовищ культивування, захисних стабілізувальних середовищ, технологічних режимів висушування на збереження рівня життєздатності мікроорганізмів, використання методу сорбційно-контактного зневоднення в біологічній промисловості.
Дослідження були спрямовані на розробку та вивчення можливості застосування технології довготривалого зберігання бактерій з використанням методу сорбційно-контактного зневоднення з метою тривалого зберігання колекційних культур бактерій.
1. Місце виконання роботи. Дисертаційна робота виконувалась на базі відділу біотехнології та контролю якості бактеріальних препаратів Державного науково-контрольного інституту біотехнології і штамів мікроорганізмів (ДНКІБШМ) у період з 2002 по 2006 роки.
2. Вибір напрямів досліджень. При розробці технології довготривалого зберігання бактерій різних таксономічних видів нами були обрані наступні напрямки досліджень:
1) проведення дослідів з підбору складових для сорбційно-контактного зневоднення та їх оптимальних співвідношень із бактеріальною суспензією;
2) вивчення впливу сорбційно-контактного зневоднення на основні біологічні властивості бактерій різних видів упродовж їх тривалого зберігання;
3) порівняльний аналіз ефективності сорбційно-контактного зневоднення з контрольним методом (у даному випадку з ліофільним висушуванням).
3. Лабораторні тварини. Лабораторні дослідження здійснені з використанням 40 голів мурчаків масою 350-400 г та 550 безпородних білих мишей масою 14-18 г. Тварин утримували на основному раціоні у віварії ДНКІБШМ в індивідуальних, спеціально обладнаних клітках із вільним доступом до води.
4. Штами мікроорганізмів. Під час проведення експериментальних досліджень нами були використані паспортизовані штами бактерій різних таксономічних видів, отримані із Національного центру штамів мікроорганізмів ДНКІБШМ: 1) виробничий штам кишкової палички - Escherichia coli № 1084; 2) виробничий штам сальмонели - Salmonella cholerae suis № 9; 3) виробничий штам стрептокока - Streptococcus faecalis "Костянтинівський"; 4) тест-штам стафілокока - Staphylococcus aureus АТСС № 25923; 5) контрольно-виробничий штам збудника бешихи свиней - Erysipelothrix rhusiopathiae № 149; 6) тест-штам клостридії - Clostridium oedematiens 198 та 7) тест-штам Bacillus cereus АТСС 11778.
Перед початком досліджень було проведено перевірку на відповідність паспортним даним основних культурально-морфологічних, тинкторіальних, біохімічних і біологічних властивостей підібраних штамів бактерій з метою визначення їх можливих змін у процесі виконання досліджень.
5. Складові сорбційно-контактного зневоднення. В експериментах були використані: 1) органічні (іонообмінні смоли марки КБ-4П-2 та КУ-2-8) та неорганічний (технічний силікагель марки МСКГ) адсорбенти; 2) дезагрегант-диспергатор біомаси (гідрофобний аеросил марки АМ 1-300); 3) посередники-зневоднювачі біомаси (лактоза та крохмаль).
У дослідах органічні адсорбенти (катіоніти) за своїми фізико-хімічними показниками (додаток А 1) відповідали вимогам і нормам ГОСТ 20298 і були хімічно стабільні, характеризувались великими можливостями зміни властивостей поверхні, структури пор та геометричної форми; являли собою катіоніт-високомолекулярні полімерні з'єднання трьохмірної гелевої макро- і мікропористої структури, що містили функціональні групи кислотного
характеру, здатні до реакцій катіонного обміну [197, 212]. Призначені іонообмінні смоли в основному для очищення, видалення, концентрування і розділення речовин, для аналітичної мети і застосовуються як каталізатор в органічному синтезі [212]. Вони не розчинні у воді, розчинах мінеральних кислот, лугів і в органічних розчинниках, нетоксичні, мають у розчині лужну реакцію [197, 212], не володіють згубною дією на біологічні об'єкти [197, 206, 209].
Із неорганічних адсорбентів в експериментах був використаний технічний силікагель марки МСКГ, який за фізико-хімічними показниками (додаток А 2) відповідав вимогам і нормам ГОСТ 3956.
Технічний силікагель - висушений гель кремнієвої кислоти пористої будови із добре розвиненою внутрішньою поверхнею [213]. Застосовують його як адсорбент для висушування й очищення повітря та інших газів або парів, для сушки й освітлення деяких рідин, як носій для каталізаторів [188, 213]. Він не розчинний у воді, розчинах мінеральних кислот і в органічних розчинниках, нетоксичний і не діє згубно на біологічні об'єкти [188, 189, 213], володіє високою біологічною стабільністю, доступний і дешевий, легко регенеруються, але в більшості випадків характеризується підвищеною розчинністю в лужних розчинах [189].
Як дезагрегант-диспергатор біомаси досліджували гідрофобний аеросил марки АМ-1-300, що являв собою інертний, рихлий порошок блакитно-білого кольору.
Висушування іонообмінних адсорбентів марки КБ-4П-2 і КУ-2-8 до залишкової вологості менше 1% здійснювали в сушильній шафі при температурі (105±5)0С впродовж 4-5 годин, а технічного силікагелю при (150-180)0С - 3-4 години, розсипавши адсорбенти тонким шаром на полиці сушильної шафи. Визначення залишкової вологості проводили згідно з ГОСТ 24061.
6. Живильні середовища та методи культивування. Під час виконання експериментальної частини роботи використовували метод періодичного
культивування підібраних і перевірених на відповідність паспортним характеристикам штамів бактерій [100]. З метою забезпечення максимального збереження культур як у процесі зневоднення, так і при наступному тривалому зберіганні бактерій при культивуванні мікроорганізмів нами були використані дозрілі, але не старі культури з максимальною концентрацією клітин; зневоднення бактерій здійснювали з використанням свіжого живильного сере