РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Об'єкт дослідження
Гострі порушення мозкового кровообігу несуть загрозу виникнення незворотних структурних ушкоджень нервової тканини і ризику розвитку з часом нейродегенеративних захворювань головного мозку. Церебральний ішемічний інсульт виникає у результаті закупорювання артерій, що живлять головний мозок. Притік артеріальної крові до головного мозку у людей та більшості ссавців відбувається через чотири артерії: дві внутрішні сонні та дві вертебральні. Вертебральні артерії об'єднуються, утворюючи базилярну артерію, яка разом із сонними формує під гіпоталамусом коло Віллізія.
Велике значення як для розуміння патогенезу ішемічного ураження головного мозку, так і для оцінки дії фармацевтичних препаратів мають експериментальні моделі in vivo. Зокрема, гризуни (щури, миші та піщанки) активно використовуються як моделі різних видів ішемії, оскільки в них нейробіологічні основи ішемічного ураження головного мозку схожі з людськими [203].
При моделюванні глобальної ішемії in vivo найчастіше використовують припинення кровопостачання всього головного мозку за допомогою чотири- або двосудинної оклюзії [148, 149, 187, 189, 203].
В моделях із чотирисудинною оклюзією найчастіше використовуються щури, а із двосудинною - піщанки. Піщанки - це вид тварин, який широко застосовують у світових наукових дослідженнях, оскільки саме у цих тварин коло Віллізія недорозвинуте і глобальна церебральна ішемія досягається шляхом перетискування лише обох загальних сонних артерій [54].
Крім того, було показано, що патобіохімічні процеси, які відбуваються при активації імунної системи людини на ішемічне ушкодження мозку, найбільш схожі з такими у піщанок, ніж у щурів [91]. Саме тому в нашій роботі ми використовували піщанок як модель глобальної церебральної ішемії головного мозку.
Як об'єкт досліджень, нами був обраний гіпокамп - структура мозку, відповідальна за процеси формування пам'яті та навчання, і нейрони якого, особливо в зоні СА1, є надзвичайно чутливими до нестачі кисню, порівняно з іншими структурами мозку [135, 216]. Окрім того, популяція нервових та гліальних клітин в гіпокампі завдяки специфічному розташуванню є найбільш придатною системою для кількісної оцінки структурних змін при ішемії мозку [114].
2.2. Розподіл тварин за групами
Усі експерименти виконані з дотриманням міжнародних принципів Європейської конвенції про захист хребетних тварин, що використовуються в експериментальних та інших наукових цілях [67].
У нашій роботі було використано 110 статевозрілих (6-7 місяців) самців піщанок монгольських (Meriones unguiculatus) (вагою 80-90 г). За добу до досліджень тварин брали з віварію і утримували в операційній кімнаті, де вони мали вільний доступ до води та збалансованого комбікорму. В кімнаті підтримувалася стала температура 22±2 0С та світловий цикл день:ніч у співвідношенні 12:12 годин. Піщанки були розподілені випадковим чином на три групи:
1 - контрольна (10 тварин) - (несправжньооперовані) тварини, у яких проводили оперативне втручання, як і при створенні ішемії, за винятком перетискування сонних артерій; їм також вводили фізіологічний розчин у еквівалентних об'ємах за протоколом введення водорозчинного кверцетину (ВК), який є комплексом кверцетину з полівінілпіролідоном (Борщагівський хіміко-фармацевтичний завод, Україна);
2 - група тварин з ішемією мозку (60 тварин), яким після ішемії вводили фізіологічний розчин у еквівалентних об'ємах за протоколом введення ВК;
3 - група тварин з ішемією (40 тварин), яким проводили профілактичне введення разової дози препарату ВК за 2 години до ішемії і далі за протоколом введення ВК.
За протоколом ВК вводили інтраперитонеально у разовій дозі 50 мг/кг маси тіла тварини (ця доза містить 5 мг/кг кверцетину): перша доба експерименту: 1-е введення відразу (через 3-5 хвилин після ішемії, 2-е введення - через 2 години, 3-е введення - через 4 години; друга доба - 2 рази на добу через 12 годин; третя - шоста доба - одноразове введення у вищевказаній дозі.
2.3. Глобальна короткотривала ішемія головного мозку
Для оперативного втручання тварин попередньо наркотизували внутрішньом'язовим введенням каліпсолу (75 мг/кг) та ксилазину (2 мг/кг), робили поперечний розтин шкіри на шиї та тупе розшарування підшкірно-жирової тканини та м'язів з подальшим відпрепаруванням обох загальних сонних артерій. Під обидві судини підводили шовкові лігатури. Ішемія головного мозку викликалась перетискуванням (оклюзією) обох загальних сонних артерій за допомогою атравматичних мікрозатискачів протягом 7 хвилин з наступним їх зняттям та відновленням кровоплину (реперфузія). Післяопераційну рану обробляли порошком стрептоциду, зашивали поліамідним шовним матеріалом і обробляли шкіру 5% спиртовим розчином йоду. Забір матеріалу для морфологічних досліджень робили на 3, 7, 14 та 28 добу після оклюзії сонних артерій.
2.4. Поведінковий тест
Для оцінки локомоторної активності усіх тварин перевіряли за допомогою тесту "відкрите поле", який дозволяв виявляти тварин з ішемічним ушкодженням мозку за рахунок їх гіперактивної поведінки [98, 107].
Рис. 2.1. Тест "відкрите поле".
Тест "відкрите поле" проводили в тестовій камері з підлогою розміром 75х75 см та стінками 50 см заввишки. Підлога була поділена на квадрати розміром 15х15 см (рис.2.1). Камера освітлювалася лампою на 60 Вт, розташованою на відстані 1,5 м від підлоги. Підраховувалася кількість квадратів, які перетинала піщанка протягом 5 хвилин.
Аналізували також ще один показник - час відпочинку у куті. Цей показник був підрахований як загальний час, який піщанка витрачала, знаходячись в кожній із чотирьох кутових зон. Перебування піщанки у кутах протягом 2 секунд і менше при сумуванні загального часу не враховувалося.
Тести для тварин з усіх трьох груп виконували протягом усього експериментального періоду тричі на день і підраховували середнє значення.
2.5. Візуалізація сп
- Київ+380960830922