РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Об'єкти досліджень
Для дослідження було взято 7 штамів фітопатогенних бактерій Ralstonia (Pseudomonas) solanacearum. Всі культури люб'язно надані куратором ICMP доктором Дж. Янгом (Нова Зеландія), за що ми висловлюємо йому щиру подяку. Вид P. solanacearum протягом декількох років двічі зазначав перекласифікації: спочатку він був перенесений до роду Burkholderia, а потім - Ralstonia. Внаслідок цього штами, одержані нами з колекції як Pseudomonas solanacearum, наразі класифікуються як Ralstonia solanacearum. Досліджувані штами R. solanacearum є представниками різних біоварів та виділені з різних рослин-хазяїв і з різних географічних зон світу (табл.2.1).
Таблиця 2.1
Походження досліджуваних штамів R. solanacearum
ШтамиРослина-хазяїнБіоварКраїна750томатиIIПортугалія6524тютюнIЗімбабве7859картопляIПеру8115томатиIФіліпіни7864бананиIКоста-Ріка8169томатиIПуерто-Ріко6189томатине визначенийНова Зеландія
2.2. Спосіб культивування
Вирощування бактерій здійснювали методом періодичного культивування на кругових качалках (n=240 об/хв) з використанням синтетичного середовища N [128] такого складу (в г/л): MgSO4·7H2O - 0,2; Na2НPO4 - 6,0; KH2PO4 - 3,0; NH4Cl - 1,0; глюкоза - 5,0, в колбах ємкістю 500 мл з робочим об'ємом 200 мл, впродовж 31-70 год (в залежності від штаму), при температурі 28 0С.
В якості посівного матеріалу використовували клітини в логарифмічній фазі росту, які вирощували на м'ясо-пептонному бульйоні. Засів проводили 10 % інокулюмом від загального об'єму живильного середовища. Для отримання ліпополіцукридів клітини збирали в кінці логарифмічної фази росту, позаклітинні глікополімери - в середині стаціонарної фази.
Клітини осаджували центрифугуванням при 5000 g, 20 хв. Осаджені клітини двічі промивали 0,9 % розчином NaCl. Для досліджень використовували висушені клітини, одержані в результаті послідовної обробки ацетоном (2 рази) і ефіром (1 раз).
2.3. Виділення і очистка ліпополіцукридів та позаклітинних глікополімерів
Ліпополіцукриди виділяли із сухої бактеріальної маси за методом Вестфаля і Янна [129, 130]. Якщо суху бактеріальну масу обробляти фенолом і водою у рівних пропорціях при 65-680С, клітини швидко руйнуються і бактеріальні речовини переходять у розчин. Водна фракція після діалізу містить бактеріальний ліпополіцукрид (вільний від білку) і нуклеїнові кислоти. 10 г сухих клітин, попередньо розтертих у порцеляновій ступці до порошкоподібного стану, суспендували 3-5 хв у 350 мл Н2О на водяній бані при 65-70 0С. Після цього додавали 350 мл підігрітого до 65-70 0С 90 % фенолу і суміш витримували при постійному перемішуванні 30-40 хв, охолоджували до ? 10 0С і центрифугували 35-40 хв при 2500 g. Відбирали верхній водний шар. Фенольний шар, інтерфазу й осад екстрагували, додаючи нову порцію води (350 мл), підігріту до 70 0С. Процедуру проводили 3-4 рази. Об'єднані водні фракції діалізували 3-4 доби проти водопровідної, а потім дистильованої води до нейтрального значення рН, після чого центрифугували при 5000 g, 20 хв, супернатант концентрували у вакуумі приблизно до 150 мл та ліофільно висушували.
Очищення ліпополіцукридів від нуклеїнових кислот здійснювали за допомогою 50 % розчину трихлороцтової кислоти (ТХО), яка утворює нерозчинні комплекси з нуклеїновими кислотами. Краплинами додавали ТХО до водного розчину ЛПЦ, витримували при 40 С впродовж 10-12 год. Центрифугували при 5000 g, 20 хв (нуклеїнові кислоти осідали), супернатант, який містив очищений ЛПЦ, діалізували до нейтрального рН і ліофільно висушували.
Позаклітинні глікополімери отримували після відділення культуральної рідини від клітин центрифугуванням при 5000 g, 20 хв. Одержаний супернатант не містив клітинних елементів досліджуваних бактерій і в подальшому використовувався для дослідження фітотоксичної дії. Супернатант концентрували під вакуумом і ліофільно висушували. Очистку позаклітинного глікополімера проводили за допомогою іонообмінної хроматографії на колонці (90,0 ? 2,0 см) з ДЕАЕ-ТСК 650 М гелі при використанні ступінчатого градієнта натрій-дигідрофосфатного буфера (0,01; 0,25 і 0,5 N NaH2PO4, при рН 6,0). Елюційні криві будували по визначенню у фракціях вуглеводів фенол-сірчаним методом (Dubois et al., 1956) [131]. Через 40 хв вимірювали оптичну щільність при довжині хвилі 490 нм. В контроль замість елюату додавали дистильовану воду.
Визначення молекулярних мас позаклітинних глікополімерів проводили гель-фільтрацією на колонці (32,0 ? 1,5 см) з сефарозою 6В. Фракції поліцукридів елюювали 0,1 М розчином оцтовокислого амонія рН 6,5. Вміст вуглеводів у фракціях (по 2 мл) визначали фенол-сірчаним методом (Dubois et al., 1956) [131]. Молекулярну масу розраховували по калібрувальному графіку, побудованому на основі використання ряду стандартів вуглеводної природи (декстранів) різної молекулярної маси: Т-40, м.м. 40 000; Т-70, м.м. 70 000; Т-5000, м.м. 500 000; Т-2000, м.м. 2 000 000.
2.4. Одержання окремих структурних компонентів
Для виділення ліпіду А, О-ПЦ і ОГ- кору проводили деградацію молекули ЛПЦ шляхом гідролізу 1 %-ю оцтовою кислотою (100 0С, 2-4 год в залежності від штаму). Ліпід А, що випадав в осад, відділяли центрифугуванням (25000 g, 40 хв), а супернатант концентрували до об'єму ? 7-8 мл і фракціонували на колонці (70,0 ? 3,0 см) з сефадексом G-50, використовуючи 0,025 N піридин-ацетатний буфер, pH 4,5.
В результаті гель-хроматографії вуглеводної частини деградованого ЛПЦ на сефадексі G-50 були отримані окремі структурні компоненти ЛПЦ: О-ПЦ (фракція I) та ОГ-кору (фракції II та III), які концентрували у вакуумі та ліофільно висушували. Профілі елюції будували на основі визначення у фракціях вуглеводів фенол-сірчаним методом [137, 130].
2.5. Методи біохімічного аналізу
Визначення кількості вуглеводів здійснювали за Dubois e