Розділ 2
Методи дослідження
2.1. Дослідження показників клітинної імунної відповіді
Для вирішення дисертаційних завдань у період 2003–2006 рр. були проведені
клінічні та імунологічні дослідження. Спостереження за 80 хворими із різними
клінічними формами розацеа (віком 20-65 років) та групою контролю, яка включала
15 практично здорових осіб віком від 18 до 65 років, проводили на базі кафедри
дерматовенерології Київської медичної академії післядипломної освіти – у
Київській міській шкірно-венерологічній лікарні і ШВД № 4.
Клінічне обстеження хворих на розацеа містило збір скарг, анамнестичних даних,
з’ясування часу прояву дерматозу, його розвитку, рецидування, сезонності,
характеру попередньої терапії. Під час збору анамнезу звертали увагу на
наявність супутньої патології з боку шлунково-кишкового тракту та
серцево-судинної системи. Особливу увагу приділяли вивченню клінічної картини
захворювання: характеру висипів, сезонності, частоти загострень, тривалості,
наявності ускладнень, поширеності.
Дослідження імунологічного стану хворих були проведені у відділі імунології ННЦ
«Інститут кардіології ім. акад. М.Д. Стражеска» АМН України.
У всіх обстежених вивчали кількість та функціональний стан лімфоцитів,
фагоцитарних клітин, нейтрофілів та моноцитів, показники гуморальної імунної
відповіді, прояви алергізації та аутоімунізації.
2.1.1. Виділення лімфоцитів, моноцитів і нейтрофілів із периферійної крові
Лімфомоноцити, моноцити та нейтрофіли виділяли із гепаринізованої венозної
крові методом фракціонування клітин у градієнті щільності фікол-верографіну
відповідно (Р = 1,12 і Р= 1,077 г/см) [41].
Гепаринізовану венозну кров ретельно перемішували з 0,15М NaСІ у співвідношенні
1:4. На двоступінчастий градієнт фікол-верографіну зверху обережно нашаровували
4 мл розведеної крові. Розподіл лімфомоноцитів і нейтрофілів відбувався у ході
центрифугування протягом 45 хв при 1500 об/хв. Клітини розподілялися між
різними шарами таким чином: між плазмою і верхнім шаром фікол-верографіну -
моноцити і лімфоцити, між верхнім і нижнім шарами – нейтрофіли [41].
2.1.2.Визначення кількості Т-, В-лімфоцитів та їх окремих субпопуляцій у
периферійній крові
Поверхневі антигени Т- та В-лімфоцитів досліджували за методом проточної
цитофлюорометрії. У роботі використовували моноклональні антитіла до СD3+,
СD4+, СD8+, СD16+, СD19+ антигенів. Лімфоцити периферійної крові отримували, як
описано вище. Підрахунок СDЗ+, СD4+, СD8+, СD19+ клітин та аналіз результатів
проводили на цитофлюориметрі FАСStаг Рlus (Весtоn-Dісkіnsоn, США) [82].
2.1.3. Оцінка функціонального стану лімфоцитів
2.1.3.1. Реакція бласттрансформації лімфоцитів із неспецифічними та
специфічними антигенами
Для встановлення проліферативної здатності лімфоцитів у РБТЛ використовували
неспецифічний мітоген ФГА, а для встановлення ступеня сенсибілізації лімфоцитів
використовували антиген до тканини шкіри. Для культивування мононуклеарів
використовували середовище 199 з додаванням 10 %-ної сироватки ембріонів телят,
глутаміну (300 мкг/мл) і гентаміцину (100 мкг/мл). Реакцію бласттрансформації
оцінювали морфологічно на третю добу після культивування у присутності ФГА (10
мг/мл). Інкубацію проводили в термостаті при температурі 37°С із забезпеченням
постійності газового середовища (повітря, що містить 5 % СО2). Потім пробірки
струшували, суспензію переносили в центрифужні пробірки і центрифугували при
2000 об/хв протягом 10 хв. Надосадову рідину зливали, а до осаду додавали
цільну сироватку і знову центрифугували. Надосадову рідину зливали, а в краплі,
які стікали по стінці пробірки, ресуспендували клітини шляхом піпетування
тонкою пастерівською піпеткою і переносили по 1 краплі на покривні скельця.
Мазки на скельцях сушили на повітрі, фіксували в метанолі 5 хв, фарбували
сумішшю азура з еозином протягом 15-20 хв, промивали водою, висушували і
мікроскопували під імерсією. Справжніми бластами вважали лімфоцити діаметром
понад 15 мкм круглої або овальної форми з нерівними краями і базофільною
цитоплазмою, що містить світлі вакуолі і оточуючою з усіх боків ядро. Для
кількісної оцінки виконували обчислення бласттрансформованих клітин з
розрахунку на 100 досліджуваних клітин [110].
2.1.4. Визначення функціонального стану фагоцитарних клітин
2.1.4.1. Дослідження внутрішньоклітинної кисневозалежної активності нейтрофілів
та моноцитів
Внутрішньоклітинну кисневозалежну активність клітин фагоцитарної системи
(нейтрофілів та моноцитів) вивчали за допомогою спонтанного та стимульованого
тесту відновлення нітросинього тетразолію (НСТ-тест) цитоморфологічним методом
[178]. При проведенні реакції використовували культуральне середовище RРМІ-1640
або 199, фетальну телячу сироватку, фосфатно-сольовий буфер, нітросиній
тетразолій (НСТ), сафранін.
При застосуванні цитохімічного методу суспензію фагоцитів (5x106 кл/мл) у
культуральному середовищі RРМІ-1640 з 5 % фетальної телячої сироватки наносили
по 0,2 мл на покривні скельця, розміщені на дні чашки Петрі малого діаметра.
Після інкубації протягом 10 хв при 37°С у водонасиченій атмосфері з постійним
рівнем СО2 (5 %) до фагоцитів вносили 0,2 мл 0,2 % розчину нітросинього
тетразолію (НСТ) у фосфатно-сольовому буфері. Цей розчин готували безпосередньо
перед використанням. У стимульованому НСТ-тесті в інкубаційне середовище
додавали по 0,2 мл пірогеналу (10 мкг/мл). У спонтанному тесті до фагоцитів
вносили 0,2 мл 0,15 М NaСІ. Клітини культивували при 37°С протягом 45 хв у
водонасиченій атмосфері з постійним рівнем СО2 (5 %). Далі скельця з фагоцитами
відмивали розчином Хенкса. Препарати висушували, фіксували у метанолі протягом
4 хв і ф
- Київ+380960830922