РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Матеріал дослідження
В нашому дослідженні проведено ретроспективний аналіз клініко-анатомічнного
матеріалу 205 хворих, який отримано під час операцій (тотальна або часткова
ларингектомія, лімфаденектомія, операція Крайля) і діагностичних біопсій з
приводу раку гортані III - IV стадій в ЛОР-онкологічному відділенні
Дніпропетровської обласної клінічної лікарні ім. І.І.Мечникова в період з 2000
по 2007р. Вік пацієнтів коливався від 38 до 74 років, середній вік складав
53,48±1,24 роки.
За гістологічною будовою всі спостереження представлені плоскоклітинними
раками, зроговілими та без зроговіння (табл. 2.1).
Таблиця 2.1
Загальний розподіл клінічного матеріалу
Гістологічний діагноз
Кількість спостережень
Зроговілі ПРГ
126
61,5
Незроговілі ПРГ
79
38,5
Всього
205
100,0
Весь клініко-анатомічний матеріал був розподілений на 3 групи (табл. 2.2):
1 група – пацієнти з високодиференційованими плоскоклітинними раками;
2 група - пацієнти з помірнодиференційованими плоскоклітинними раками;
3 група - пацієнти з низькодиференційованими плоскоклітинними раками.
Таблиця 2.2
Загальний розподіл клінічного матеріалу за групами
Гістологічний діагноз
Кількість спостережень
Високодиференційовані ПРГ
49
23,9
Помірнодиференційовані ПРГ
124
60,5
Низькодиференційовані ПРГ
32
15,6
Всього
205
100,0
На початку нашого дослідження був відібраний матеріал 239 пацієнтів. Після
ретельного аналізу матеріал 26 пацієнтів було виключено через недостатність
матеріалу, залишеного у парафінових блоках, матеріал 8 - у зв’язку з
неможливістю проведення імуногістохімічного дослідження через неправильну
обробку післяопераційного та біопсійного матеріалу.
2.2. Методи дослідження
Відповідно до мети і задач дослідження був використаний комплекс методів
морфологічного, імуногістохімічного, морфометричного, статистичного аналізу.
2.2.1. Морфологічні методи дослідження
Для проведення морфологічного дослідження використовували парафінові блоки
операційного та біопсійного матеріалу у випадках раку гортані та його
метастазів у лімфатичні вузли. Для отримання зрізів використовували мікротом зі
станцією прийому зрізів (Microm HM-340), що дозволило готувати серійні зрізи та
оцінювати тотожні ділянки пухлинної тканини при подальшому проведенні ІГХ
реакцій. Парафінові зрізи товщиною 4-6 мкм забарвлювали гематоксиліном та
еозином за стандартною методикою та піддавалися ретельному мікроскопічному
дослідженню. Мікроскопію проводили за допомогою світлового мікроскопа Leіca
DMLS з використанням об’єктивів Ч10, Ч20, Ч40, Ч100.
2.2.2. Імуногістохімічні методи дослідження
В основі імуногістохімічного методу дослідження лежить специфічна взаємодія
поліклональних або моноклональних антитіл з антигенами тканини, яка виявляється
завдяки відповідній мітці на світлооптичному рівні. Дана методика дозволяє
виявляти різноманітні структурні елементи, рецептори та продукти синтезу клітин
та позаклітинного простору. Для виявлення реакції зв’язування антиген-антитіло
використовуються різноманітні системи візуалізації.
В новітніх системах останнього покоління для цього використовують полімерні
молекули декстранів, на яких містяться вторинні антитіла, імуногенні до
первинних, та численні молекули пероксидази. Це дозволило скоротити
імуногістохімічне дослідження до двох кроків та підвищити його чутливість та
специфічність, насамперед за рахунок виключення із системи біотину, що
використовувався у системах попередніх поколінь та інколи призводив до
помилковопозитивних результатів. Пероксидаза - фермент, виділений з кореня
хрону, розщеплює перекис водню та призводить до відкладення хромогену DAB
(3-діамінобензидина тетрахлорід), що проявляється в забарвлені продуктів
реакції в інтенсивно коричневий колір, і, таким чином, дозволяє ідентифікувати
місце зв’язування шуканого антигену з моноклональним антитілом. В свою чергу,
дана методика потребує попереднього блокування активності ендогенної
пероксидази тканини специфічною рідиною, що містить перекис водню. Останнє не
потрібно при використанні на полімері замість пероксидази лужної фосфатази. За
цієї умови в якості хромогену використовується Стійкий Червоний, а реакція
виявляється у вигляді інтенсивного червоного забарвлення.
В нашому досліджені зрізи товщиною 4-6 мкм наносили на спеціальні адгезивні
предметні стекла SuperFrost Plus, потім депарафінізовували відповідно до
прийнятих стандартів. У зв’язку з тим, що при фіксації в формаліні відбувається
порушення структури антигенних детермінант, яке призводить до зниження їх
імуногенності, необхідним етапом ІГХ дослідження було проведення теплової
індукції епітопного (антигенного) звороту (HІER - heat іnductіon of epіtope
retrіeval), в результаті якого відновлювались антигенні властивості тканини. Ми
використовували нагрівання в цитратному буфері з рН=6,0 в автоклаві (8 хвилин
при температурі +1210С) із симетричним розташуванням стекол у кюветі. Значення
рН буферного розчину має важливе значення і для деяких антитіл може мати різні
показники, наприклад 6,3 або 9,0. Крім того, повинні витримуватись параметри
експозиції та температури демаскування, порушення яких може привести до
неповного відтворення антигенів або, навпаки, неспецифічного зв’язування
антитіл, а також зморщування та відпадання зрізів [68].
В нашому досліджені в якості первинних використовувалися моноклональні антитіла
до цитокератину 19 (клон ВА17, DakoCytomation), високомолекулярного
цитокератину (клон 34вЕ12, DakoCytomation), онкопротеїну р53 (клон DO-7,
DakoCytomation), Ki-67 (клон MIB-1, DakoCytomation), онкопротеїну bcl-2
- Київ+380960830922