РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Для дослідження взято двадцять похідних 1-адамантилетилокси-3-діалкіламіно-2-пропанолу з лабораторними шифрами ЮК-1 - ЮК-20, синтезованих в Інституті органічної хімії НАН України під керівництвом акад. НАН України, проф. М.О. Лозинського. В якості препаратів порівняння на різних за генезом патологічних станах використовулись бемітил, синтезований на експериментальному заводі Інституту органічної хімії НАН України та ампульний розчин пірацетаму 20 % ("Дарниця", Україна).
Експерименти проведено на 814 білих нелінійних щурах, обох статей, масою 160-280 г та 420 білих мишах масою 16-23 г. Всі тварини утримувались у віварії ВНМУ на стандартному водно-харчовому раціоні при вільному доступі до води та їжі. Під час роботи з лабораторними тваринами було дотримано рекомендацій Європейської комісії щодо проведення медико-біологічних досліджень з використанням тварин та методичними рекомендаціями Державного фармакологічного центру МОЗ України. Досліди проводили з урахуванням "Правил доклінічної оцінки безпечності фармакологічних засобів (GLP)" [91] та відповідно до вимог комісії з біоетики ВНМУ (протокол № 13 від 20 червня 2007 року). Дослідження проходили в лабораторії кафедри фармакології ВНМУ, сертифікованої ДФЦ МОЗУ (посвідчення № 1 від 23.02.2006 р.). Евтаназію тварин проводили шляхом передозування ефіру.
Розподіл тварин за дослідними групами в проведеному дослідженні наведено в табл. 2.1.
Таблиця 2.1
Розподіл тварин за дослідними групами
Групи тваринКількістьДосліди на мишах:
1. Дослідження гострої токсичності
420Досліди на щурах:
2. Скринінг актопротекторної дії
2593. Оцінка актопротекторних властивостей досліджуваних речовин в ускладнених умовах:3.1. при гіпертермії42 3.2. при гіпотермії42 3.3. при нормотермії42 3.4. при гемічній гіпоксії49 3.5. при ішемії мозку98 3.6. при гіпокінезії1044. Вивчення механізмів актопротекторної дії вивчаємих сполук: 4.1. Дослідження протигіпоксичної активності 4.1.1. на моделі гострої асфіксії42 4.1.2. на моделі ГПМК80 4.2. Дослідження біоенергетичних процесів56
Дослідження гострої токсичності похідних адамантану проведено на 420 нелінійних мишах обох статей, масою 16-23 г, з дотриманням методичних рекомендацій Державного фармакологічного центру [91]. Досліджувані речовини вводили одноразово внутрішньоочеревинно у вигляді водних розчинів 1-5 % концентрацій. Кожну дозу вивчали на групі з 5 тварин. Спостереження велось протягом 7 діб. Показник ЛД50 та його довірчий інтервал розраховували за графічним методом Литчфілда-Уілкоксона [23].
Скринінг актопротекторної активності досліджуваних похідних адамантану був здійснений за допомогою плавальної проби [78, 240, 241]. Експерименти проведені на 259 білих нелінійних щурах, обох статей, масою 160-280 г. В якості критерію актопротекторної ефективності досліджуваних сполук та еталонного актопротектора бемітилу використовували показник тривалості плавання щурів у воді t 24-26 0С з додатковим навантаженням (10 % від маси тіла), що кріпилось до кореня хвоста. Визначали час плавання щурів до появи ознак повної втоми (занурювання, опускання на дно). Сполуки, що вивчались, вводили тваринам у вигляді водних розчинів одноразово внутрішньоочеревинно за 40-50 хв до початку дослідження в дозах, що становили 5 % від їх ЛД50. Препарат порівняння бемітил застосовували таким же чином в терапевтично ефективній дозі 50 мг/кг [124]. Щурам контрольної групи в цьому і в подальших дослідженнях вводили внутрішньоочеревинно еквівалентну кількість 0,9 % розчину NaCl.
В подальшому для найактивніших за проведеним дослідженням сполук (ЮК-1, ЮК-4, ЮК-16, ЮК-20) додатково досліджували ще по 2-3 дози в умовах плавальної проби. Кожна доза сполук вивчалась на групі з 7 тварин.
Для досліджуваних препаратів з чіткою актопротекторною дією на даній моделі фізичної витривалості щурів розраховували ЕД50 - середньо ефективну дозу препарату, яка сприяла зростанню тривалості плавання тварин на 50 % по відношенню до контрольної групи та величину терапевтичного індексу (ТІ). ЕД50 розраховували графічно за методом Литчфілда-Уілкоксона [23]. В подальших дослідженнях були використані саме ЕД50. Терапевтичний індекс, що характеризує широту лікувального ефекту та безпечність препарату, розраховували за формулою:
(2.1)
Фізичну витривалість тварин в ускладнених умовах вивчали під дією найбільш активних за попередніми експериментами сполук (ЮК-1, ЮК-4, ЮК-16, ЮК-20) в порівнянні з бемітилом. З цією метою моделювались різні фактори, ускладнюючі фізичну працездатність.
Так, була використана модель плавальної проби в гіпо-, гіпер- та нормотермічних умовах. Дослідження проведені на 126 білих нелінійних щурах обох статей, масою 160-280 г. При цьому визначали тривалість плавання тварин з додатковим навантаженням (10 % від маси тіла) під дією досліджуваних сполук до появи ознак повної втоми (занурювання) при гіпотермії - у температурі води 10 ?С (фригопротекторна активність), гіпертермії - при 40 ?С (термопротекторна активність) та нормотермії- при 35-37 ?С [233, 240, 254]. Досліджувані сполуки, як і еталонний актопротектор бемітил, вводили внутрішньоочеревинно (в/о) за 40 хв до плавального тесту в дозах, що становили їх ЕД50 за попередніми дослідженнями.
Фізичну працездатність оцінювали також в ускладнених гіпоксією умовах. Для моделювання гострої гемічної гіпоксії застосовували одноразове введення тваринам підшкірно метгемоглобіноутворювача - натрію нітриту (NaNO2) в дозі 20 мг/кг [63, 193, 240]. Досліджувані речовини вводили в/о за 40-50 хв до введення метгемоглобіноутворювача в дозах, що становили їх ЕД50 за попередніми експериментами. Для оцінки актопротекторної дії сполук, що вивчались, в ускладнених гіпоксією умовах досліджували фізичну працездатність за тривалістю плавальної проби щурів з попередньо модельованою гострою г