РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Проведено обследование 53 условно здоровых доноров и 218 ликвидаторов
последствий аварии на ЧАЭС, получивших дозовую нагрузку ионизирующей радиации
от 0,02 до 0,25 Зв. Все обследованные были мужского пола в возрасте от 29 до 58
лет.
Опозитную группу составили 23 пациента с заболеваниями желудочно-кишечного
тракта и дыхательной системы в возрасте от 17 до 49 лет.
Ликвидаторы подвергались скринингу по разработанному в лаборатории
диагностическому протоколу с учетом сроков пребывания в зоне аварии,
радиационного анамнеза, изменения показателей иммунореактивности, гемостаза,
гормонов и липидного обмена, сопутствующей соматической патологии. Верификация
диагнозов проводилась клиницистами ГУ «Институт общей и неотложной хирургии АМН
Украины». У ЛПА были диагностированы заболевания желудочно-кишечного тракта и
дыхательной системы.
Обследованные ЛПА были разделены на 2 группы в зависимости от сроков пребывания
в зоне аварии. В первую группу вошли лица, участвовавшие в ликвидации
последствий аварии в 1986 г., вторую группу составили лица пребывавшие в зоне
повышенной радиации в 1987 г. При анализе полученных данных основные группы
обследуемых классифицировали на подгруппы в зависимости от полученной дозы
ионизирующей радиации, от возраста и характера иммунореативности.
Для оценки изменений общей реактивности организма изучали состояние клеточных и
гуморальных иммунных реакций, факторов неспецифической резистентности
организма.
2.1. Метод определения субпопуляций иммунокомпетентных клеток с помощью
моноклональных антител
Для определения субпопуляций иммунокомпетентных клеток использовали
специфические моноклональные антитела (МКАТ) изготовленные в Институте
экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им. Р.Е. Кавецкого НАН
Украины.
При постановке непрямого иммунофлюорисцентного метода специфические
моноклональные антитела (МКАТ), меченные FITC (с помощью вторичной сыворотки),
связываются с соответствующим поверхностным антигеном клетки. В люминесцентный
микроскоп производили подсчет клеток меченых FITC [67].
2.2. Определение уровня субпопуляции активных Т-лимфоцитов
Количество розеткообразующих Т-лимфоцитов рассчитывалось после проведения
реакции спонтанного розеткообразования лейкоцитарной взвеси с эритроцитами
барана.
Для получения лейкоцитарной взвеси клетки гепаринизированной крови разделяли в
градиенте плотности фикол-верографин центрифугированием при 1500 об/мин 20
минут. Подсчет Е-РОК акт путем микроскопирования проводили сразу после
разделения фаз. Микроскопирование осуществляли под микроскопом "БИОЛАМ Р-15", а
подсчет клеток проводили с помощью счетчика "Гематест-1".
Гуморальные иммунные реакции характеризовали по уровню циркулирующих иммунных
комплексов (ЦИК), аутоиммунных антител, иммуноглобулинов классов А, М и G в
сыворотке крови. Для установления размеров ЦИК определяли их константу.
2.3. Определение концентрации циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке
крови
Содержание ЦИК в сыворотке крови определяли методом преципитации [72]. В
качестве преципитирующего реагента использовали полиэтиленгликоль (ПЭГ) 6000. К
0,2 мл сыворотки крови добавляли 4,8 мл боратного буфера – 0,1 М, рН 8,4,
содержащего 3% ПЭГ. После этого проби тщательно перемешивали и инкубировали на
протяжении 18 часов при температуре 40С. Затем проводили 20 минутное
центрифугирование при 2000 g. Супернатант отделяли и к осадку добавляли 2 мл
раствора 100 мМ NaОН. Измерение оптической плотности проводилось
спектрофотометрически на СФ-46 при длине волны l=450 нм против боратного
буфера.
Антигены (АГ) и антитела (АТ), входящие в состав циркулирующих иммунных
комплексов (ЦИК), существенно отличаются по валентности, размеру, заряду,
стерическому распределению детерминант и др. Такое разнообразие свойств
антигенов и антител и их соотношений приводит к формированию иммунных
комплексов, существенно различающихся по физико-химическим и биологическим
свойствам.
2.4. Метод определения константы циркулирующих иммунных комплексов
Принцип метода определения константы ЦИК [42] основан на селективной
преципитации ЦИК в градиенте плотности ПЭГ 6000. Пробы после внесения
различного количества (1,5 мл и 2,0 мл) 5% раствора ПЭГ 6 000 (проба 1 и проба
2 соответственно) инкубировали 18 часов при 4 °С для образования иммунных
комплексов. После центрифугирования при 2000 об/мин в течение 17 минут отделяли
надосадочную жидкость. Надосадочную жидкость разводили 1 N гидроксидом натрия и
спектрофотометрически определяли оптическую плотность при длине волны l=280 нм
против гидроксида натрия. Константу ЦИК рассчитывали по формуле:
ЦИК к = D 2/ D 1, где
D 1 - оптическая плотность в пробе 1;
D 2 - оптическая плотность в пробе 2.
2.5. Метод определения содержания сывороточных иммуноглобулинов классов А, М и
G
Определение содержания сывороточных иммуноглобулинов классов А, М и G
осуществляли спектрофотометрически на АИФ–Ц-01С (Беларусь, Витебск, ПО
«Витязь»). Для определения концентрации использовали стандартный набор
моноспецифических антисывороток к иммуноглобулинам каждого класса и контрольную
сыворотку с известным содержанием иммуноглобулинов (г/л) (изготовитель НИИ
эпидемиологии и микробиологии им Н.Ф. Гамалеи, г. Москва; АО “Биомед” им. И.И.
Мечникова, г. Москва). Образцы, контрольную сыворотку и антисыворотки вносили в
лунки планшета и прибавляли 7% раствор ПЭГ 6 000 в фосфатном буфере (pH
7,4-7,5). Пробы инкубировали 60 минут при комнатной температуре. Оптическую
плотность измеряли в бихроматическом режиме
- Київ+380960830922