РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Представлені у роботі дані одержані на експериментальному матеріалі.
Для досягнення поставленої мети були виділені, очищені та охарактеризовані
цитотоксичні білоквмісні метаболіти фільтрату культуральної рідини (ФКР)
Bacillus subtilis B-7025. З їх використанням та клітин експериментальних
злоякісних пухлин були виготовлені ПВ, ефективність і механізми дії яких
досліджували при перещепленні гомологічних пухлин in vivo.
Імунологічне обстеження тварин включало: забір імунокомпетентних органів на 7-,
14-, 21- та 28-у добу пухлинного росту; визначення функціональної активності Лц
і Мф та рівня їх кооперативної взаємодії; АЗЦ вищезазначених ефекторів
протипухлинного імунітету та рівень середньомолекулярних ЦІК. Ефективність ПВ
визначали за динамікою розвитку пухлини (об’ємом пухлинного вузла) та середньою
тривалістю життя тварин з пухлинами.
2.1. Експериментальні тварини
Використовували мишей ліній C57Bl/6 (самці віком 2-2,5 міс., масою 18-20 г),
Balb/с (самці віком 2-2,5 міс, вагою 20-23 г), DBA (самці віком 2,5–3,5 міс.,
масою 21–23 г), С3Н (самці віком 2-2,5 міс, вагою 20-23 г) та неліних мишей
(самці віком 2,5–3,5 міс., масою 20–23 г).
Всі тварини були одержані з розплідника віварію ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН
України. Утримання мишей та робота з ними здійснювались у відповідності до
міжнародних прийнятих правил проведення робіт з експериментальними тваринами.
Характеристика ліній мишей [254]:
а) C57Bl/6 – не мають “фактора молока”. Частота пухлин молочних залоз не
перевищує 1 %, частота спонтанних пухлин інших локалізацій теж низька;
б) Balb/с – частота пухлин молочних залоз низька (до 5 %), не мають “фактора
молока”, але їх тканини є пермісивними для його розмноження. Пухлини легень
виникають у 25-30 % тварин. Сприйнятливі до хронічної пневмонії. Миші дуже
чутливі до онкогенних ретровірусів.
в) DBA – отримана К. Літтлом в 1909 р. Миші світло-коричневого кольору. Мають
високу частоту спонтанних та індукованих пухлин, таких як пухлини молочної
залози, печінки, легень або лейкози.
г) С3Н –частота пухлин молочних залоз висока (95%), пухлини легень виникають у
5-10%.
Утримання мишей та робота з ними проводилися у відповідності до
загальноприйнятих міжнародних правил виконання робіт з експериментальними
тваринами [255].
Всього було використано 916 тварин, які були отримані з розплідника віварію
Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є.
Кавецького НАН України.
2.2. Експериментальні модельні системи пухлинного росту
Дослідження проведені з використанням стандартних штамів експериментальних
пухлин [256], які були одержані з Клітинного Банку тканин людини і тварин ІЕПОР
ім. Р.Є. Кавецького НАН України. В експерименті використовували асцитні та
солідні форми пухлин. Пухлинні клітини саркоми 37, карциноми легені Льюїс та
карциноми Ерліха трансплантували внутрішньом’язево (в/м) у кількості
1х106кл/тварину. ПК L1210 (лімфоїдна лейкемія) інокулювали в черевну порожнину
у кількості 5х105кл/тварину.
2.2.1. Саркома-37 (S37) – пухлина виникла спонтанно в 1906 р. у старої
лабораторної миші-самки, первинно ідентифікована, як аденокарцинома молочної
залози. В процесі перещеплення пухлина трансформувалась у недиференційовану
поліморфно-клітинну саркому [257]. Для індукції пухлин ПК S37 вводили
внутрішньом’язево (в/м) в праву задню кінцівку в дозі 1х106 кл/тварину в 0,3
мл.
2.2.2. Епідермоїдна метастазуюча карцинома легені Льюїс (КЛЛ). Підтримується
пасажами на мишах C57Bl/6; при цьому пухлинні клітини вводили в/м по 2,5-5х105
кл/мишу в 0,2 мл. Для трансплантації використовували суспензію клітин, яку
готували за методикою, що базується на попередній трипсинизації пухлини [257].
Для індукції пухлин при виконанні досліджень клітини КЛЛ вводили в/м в праву
задню кінцівку у дозі 1х106 кл/мишу в 0,3 мл.
2.2.3. Рак Ерліха (РЕ) – вихідною пухлиною для штаму солідної аденокарциноми
Ерліха слугував спонтанний рак молочної залози нелінійної миші, який виник в
1905 році. Асцитна форма пухлини Ерліха була одержана в 1932 р. шляхом
перещеплення солідної аденокарциноми Ерліха в черевну порожнину [257]. Для
індукції пухлин при виконанні досліджень клітини АЕ вводили в/м в праву задню
кінцівку у дозі 1х106 кл/мишу в 0,3 мл.
2.2.4. Пухлина L1210 (L1210) – гострий лімфолейкоз, який використовується для
тестування протипухлинної ефективності хімічних сполук. Штам перевивається
тільки певній лінії тварин. Підтримується в асцитній формі [257]. Для індукції
пухлин при виконанні досліджень клітини L1210 вводили в черевну порожнину у
кількості 5х105 кл/мишу в 0,3 мл.
Перебіг пухлинного процесу характеризували за розміром пухлинного вузла (об’єм
в см3)
де R – радіус пухлинного вузла;
2.3. Штами мікроорганізмів
2.3.1. Bacillus subtilis В-7025 – спороутворююча грампозитивна сапрофітна
бактерія. Даний штам одержаний методом аналітичної селекції з штаму Bacillus
subtilis АБ-56, виділений Д.Г. Затулою [258], і задепонований у колекції
Інституту мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України (Київ,
Україна). Біологічно-активні речовини глікопротеїдної та лектинової природи,
які продукує ця бактерія, використовуються для приготування протипухлинних
аутовакцин [259]. Культивування B. subtilis В-7025 на м`ясопептонному бульйоні
проводили періодичним способом на качалках (160–220 об/хв) або у термостаті в
матрацах ємкістю 1 л з робочим об`ємом 300 мл при температури 37єС протягом
7–10 діб [260].
ФКР B. subtilis В-7025 одержували шляхом фільтрації центрифугату КР
7–10-добової бульйонної культури бактерії крізь керамічний фільтр (500g, 20
хв). О
- Київ+380960830922