розділ 2
матеріали та методи дослідження
Дисертаційну роботу виконано в базовому лікувальному закладі кафедри дитячих
інфекційних хвороб Харківського національного медичного університету (ХНМУ)
(завідувач кафедри – д.мед.н., професор С.В. Кузнєцов) – обласній дитячий
інфекційній клінічній лікарні (ОДІКЛ) м. Харкова (головний лікар – Д.І. Кухар).
Лабораторні дослідження проведено у клінічній, бактеріологічній,
вірусологічній, біохімічній лабораторіях ОДІКЛ, лабораторії кафедри та
імунологічній лабораторії регіонального дитячого центру клінічної імунології
обласної клінічної лікарні №1 м. Харкова.
Під спостереженням знаходилися 94 дитини віком одного місяця – трьох років,
хворих на кишкову інфекцію, з них 30 – хворих на ротавірусну моно- (РВІ) та 64
– мікст-інфекцію (РВМІ).
Вік та стать хворих представлено в табл. 2.1.
Таблиця 2.1
Розподіл хворих за статтю та віком
Стать
1-6 міс.
7-12 міс.
13-24 міс.
25-36 міс.
Всього
абс.
абс.
абс.
абс.
абс.
Чоловіча
12
12,8
12
12,8
15
16,0
9,6
48
51,1
Жіноча
11
11,7
13
13,8
15
16,0
7,4
46
48,9
Всього
23
24,5
25
26,6
30
31,9
16
17,0
94
100
Методика роботи включала: аналіз скарг, вивчення анамнезу захворювання,
епідеміологічного анамнезу та анамнезу життя дітей, ретельне клінічне та
лабораторне обстеження (клінічні дослідження крові та сечі, копрологічні,
бактеріологічні, серологічні та інші дослідження).
Верифікація діагнозу кишкової ротавірусної інфекції здійснювалася шляхом
виявлення ротавірусного антигену в калових масах хворих методом
імуноферментного аналізу (ІФА), визначення титру антитіл до нього в сироватці
крові в динаміці захворювання (ІФА). Всім дітям проведено бактеріологічне
обстеження випорожнень, результати якого представлено в табл. 2.2.
Таблиця 2.2
Результати бактеріологічного дослідження
Мікроорганізми, що виділені
абс.
Патогенні бактерії:
16
19,8
Shigella, в тому числі:
9,9
S. Sonnei
8,6
S. Flexneri
1,2
E. coli, в тому числі:
7,4
E. coli O1
2,5
E. coli O44
1,2
E. coli O75
1,2
E. coli O151
2,5
Salmonella, в тому числі:
2,5
S. enteritidis D
2,5
Умовно-патогенні бактерії:
65
80,2
Klebsiella pneumoniae
38
46,9
Proteus, в тому числі:
27
33,3
P. mirabilis
16
19,8
P. vulgaris
11
13,6
Всього
81
100
Всім дітям, у яких з калових мас виділені мікроорганізми, проведено серологічне
обстеження (реакція аглютинації (РА)) з аутоштамами в динаміці спостереження. З
81 хворого у 64 (79,0%) в крові виявлено наростання в динаміці титру антитіл до
виділених бактерій в чотири та більше разів, що дало нам можливість говорити
про їх причетність до розвитку патологічного процесу в шлунково-кишковому
тракті дітей, тобто діагностувати сполучену природу захворювання. Це, в свою
чергу, дозволило розділити всіх хворих на дві групи: перша група – 30 дітей,
враження ШКТ у яких обумовлено тільки ротавірусами (РВІ), друга група – 64
дитини, захворювання у яких викликано сполученою дією ротавірусів та бактерій
(РВМІ).
В основу формулювання діагнозу покладено етіологію, клінічну форму, тяжкість та
перебіг захворювання; при цьому формулювання діагнозу за вищезазначеними
ознаками не суперечило класифікаціям, що застосовуються вченими та лікарями
України і Росії [23, 128].
Всім хворим в гострому періоді захворювання та в періоді ранньої
реконвалесценції поряд з загальноклінічними лабораторними дослідженнями
проведені спеціальні імунологічні: визначення кількісного вмісту інтерлейкінів
(1b, 4, 6, фактор некрозу пухлини), популяцій та субпопуляцій імунних клітин
(СD3+, СD4+, СD8+, СD14+, СD19+) крові та імуноглобулінів основних класів (A,
M, G) сироватки.
Визначення рівнів інтерлейкінів крові проводили твердофазним імуноферментним
методом [139] із застосуванням стандартних наборів реагентів ProCon IL-1b,
ProCon IL-4, ProCon IL-6, ProCon TNF-a виробництва «Протеиновый контур» (м.
Санкт-Петербург, Росія). Периферійну кров у кількості 1 мл, що була набрана у
хворої дитини натще з периферійної вени, після згортання центрифугували при
швидкості 3000 об/хв та виділяли сироватку. Як індикаторний фермент
застосовували пероксидазу, в якості твердої фази – планшети з сорбованими на їх
внутрішній поверхні антитілами до інтерлейкінів. Розрахунки кількісного вмісту
інтерлейкінів у сироватці крові проводили за допомогою калібровальної кривої
«оптична щільність/концентрація».
Визначення кількісного вмісту популяцій та субпопуляцій імунних клітин крові
проводили методом непрямої імунофлюоресценції з використанням моноклональних
антитіл до поверхневих антигенів лімфоцитів СD виробництва ВАТ «Сорбент» (м.
Москва, Росія). У методиці антитіла мітили флюорохромом, який флюоресцував під
дією світла довжиною хвилі 488 нм [139].
Проводили визначення рівня СD3+ - Т-лімфоцитів, СD4+ - Т-хелперів, СD8+ -
цитотоксичних лімфоцитів, СD14+ - моноцитів та макрофагів, СD19+ -
В-лімфоцитів. Периферійну кров у кількості 1 мл збирали натще з периферійної
вени з додаванням гепарину (з розрахунку 5 од/мл), при цьому зразки з гемолізом
або фібриновим згустком у дослідженні не використовували. Лімфоцити виділяли на
градієнти щільності Фікол-Верографіну (1,007 г/мл), потім додавали мічені
флюорохромом моноклональні антитіла та інкубували отримані зразки при
температурі +37,00С протягом 30 хвилин, готували мазки та досліджували їх за
допомогою флюоресцентного мікроскопу Люмам Р-8 виробництва Ленінградського
оптико-механічного об’єднання «ЛОМО» з використанням об’єктиву 90х та окуляру
7х, застосуванням набору фільтрів,
- Київ+380960830922