РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Методы и условия выращивания
Экспериментальные работы выполнялись на базе отдела биотехнологий и
фиторесурсов ИнБЮМ НАНУ и предприятия «Кайлас» (Крым). В работе использовали
модифицированные питательные среды Тренкеншу [97] и Ben-Amotz [194]. Суть
модификации состояла в увеличении солености среды за счет добавления хлорида
натрия или морской соли до концентрации 120 г/л, а также в эквимолярной замене
нитрата натрия и гидрофосфата натрия нитратом калия и гидрофосфатом калия. Для
приготовления сред, используемых в экспериментах, использовались реактивы
квалификации х.ч. и ч.д.а.
В зависимости от поставленных задач выращивание дуналиеллы осуществляли
методами накопительной, квазинепрерывной и непропорционально проточной
культуры. Например, квазинепрерывную культуру со скоростью протока 0,1 сут-1
получали путем периодической (с интервалом в 24 ч) замены 1/10 части суспензии
микроводоросли равноценным объемом свежеприготовленной среды. При
непропорционально проточном выращивании перед выполнением описанного выше
10%-ного обмена дополнительную часть биомассы удаляли при помощи фильтрования
или центрифугирования.
В качестве инокулята использовали штаммы D. salina IBSS-1, IBSS-2 и IBSS-3 из
коллекции ИнБЮМ НАНУ. Штамм IBSS-1 выделен из пробы фитопланктона гиперсоленого
озера Сиваш (Крым) Марковой Л.С. (ИнБЮМ НАНУ). Штаммы IBSS-2 и IBSS-3 получены
из коллекции водорослей Института гидробиологии НАНУ (г. Киев), где числятся
под акронимами HPDP-11 и HPDP-12, соответственно. Инокулят вносили в
культиваторы с таким расчетом, чтобы начальная плотность во всех вариантах
опыта была одинаковой (? 0,2 г АСВ/л).
Таблица 2.1
Модифицированная среда Тренкеншу
Компонент
Навеска, г·л-1
Морская соль
120
KNO3
2,139
KH2PO4 Ч 7H2O
0,365
Na2EDTA
0,040
FeSO4 Ч 7H2O
0,040
MnCl2 Ч 4H2O
0,0040
CoCl2 Ч 6H2O
0,0031
(NH4)6Mo7O24 Ч 4H2O
0,0009
K2Cr2(SO4)4 Ч 24H2O
0,0017
Эксперимент № 1. Рост Dunaliella salina в смешанной культуре (июнь - октябрь
2004 г.). Работа выполнена на базе предприятия «Кайлас» (Крым). Культиваторами
служили прямоугольные бассейны 2 Ч 2,5 м из пищевой полиэтиленовой пленки
толщиной 150 мкм, уложенной на выровненную поверхность грунта и закрепленной на
ограждающих конструкциях с помощью деревянных планок. Для культивирования
использовали модифицированную питательную среду Ben-Amotz. Пресную воду для её
приготовления брали из скважины, расположенной на территории предприятия.
Источником NаCl, MgSO4, CaCl2 в среде служила морская соль. Культиваторы
размещались в стандартной стеклянной теплице для выращивания
сельскохозяйственных культур. В эксперименте водоросли выращивали при
естественном освещении методом непрерывных культур. Максимальная освещенность в
географический полдень (12:30) достигала 110 кЛк. Суточная температура
колебалась в пределах 24 – 36єС (первые два этапа эксперимента) и 16 – 28єС
(третий этап эксперимента).
Таблица 2.2
Модифицированная среда Ben-Amotz.
Компонент
Навеска, г·л-1
Морская соль
120
KNO3
0,505
KH2PO4 Ч 7H2O
0,038
Na2EDTA
0,040
FeSO4 Ч 7H2O
0,00054
MnCl2 Ч 4H2O
0,0001
CuCl2Ч 7H2O
0,0001
ZnCl2Ч 4H2O
0,0001
CoCl2 Ч 6H2O
0,0001
10
(NH4)6Mo7O24 Ч 4H2O
0,0012
Ежесуточный обмен составлял 10 %. Объем культуры в каждом культиваторе
составлял 250 л, при высоте слоя раствора 5 см. Этот объем на протяжении всего
эксперимента поддерживали постоянным, доливая пресную воду перед измерениями до
отметки 5 см. Культуры постоянно перемешивали с помощью аквариумного
электронасоса «Струмок». Суспензии микроводорослей барботировали газовоздушной
смесью, которую создавали с помощью аквариумного компрессора «Maxima»,
производительностью 4,8 л/мин и углекислоты из газового баллона высокого
давления. Углекислоту смешивали с воздухом в микрокамере из полиэтиленовой
трубки. Подачу углекислоты в смеситель осуществляли через тонкий капилляр
(медицинскую иглу).
Эксперимент № 2. Потребление азота и фосфора микроводорослью Dunaliella salina
при различных режимах культивирования (2004 г.). Работа выполнена на базе
отдела биотехнологий и фиторесурсов ИнБЮМ НАНУ. Установка для культивирования
состояла из культиваторов плоскопараллельного типа, изготовленных из оргстекла
и снабженных термостабилизирующей системой [20]. Эксперимент проводился в 3-х
повторностях. Объем суспензии в каждом культиваторе равнялся 10 л. При
выращивании D. salina использовался барботаж газовоздушной смесью с добавлением
углекислоты для обеспечения культуры углеродом и для стабилизации рН (8 - 9
ед.). Освещенность на поверхности культур составляла в среднем 21 кЛк (лампа
ДРЛ-700), температура питательного раствора изменялась в диапазоне от 26 до
28°С. На начальном этапе эксперимента водоросли выращивали накопительным
методом. Начиная с 6 дня, эксперимент продолжили в квазинепрерывном режиме с
удельной скоростью протока 10 % сут-1. На 9-й день эксперимента режим подачи
углекислоты изменили на периодический, т.е. осуществляли 4-х разовую подачу
углекислоты в течение дня по 30 мин. Данный режим поддерживали до 20-го дня.
Позднее эксперимент повторили при тех же условиях, кроме объёма культиваторов и
их рабочего оптического пути – 5 л и 5 см, соответственно.
Эксперимент № 3. Dunaliella salina Teod. IBSS-2 – перспективный штамм для
промышленного культивирования (2005 г.). Объекты исследования – три штамма
зеленой галобной микроводоросли Dunaliella salina Teod. из коллекции культур
ИнБЮМ НАН Украины: IBSS-1, IBSS-2, IBSS-3.
Работа выполнена на базе отдела биотехн
- Київ+380960830922