розділ 2
Матеріали та методи дослідження
2.1. Обсяг експериментального матеріалу
Дослідження виконані в лабораторії фармакології і тканинної терапії ІОХіТТ ім.
В. П. Філатова АМН України, яка сертифікована Державним Фармакологічним Центром
(ДФЦ) МОЗ України (посвідчення № 31 від 2006 р.) у повній відповідності з
вимогами комісії з біоетики ІОХіТТ (протокол № 8 від 7.11.2006 р.) та
Методичними рекомендаціями ДФЦ [273].
Нами розроблено препарат гумінат у двох стандартних формах: порошок і розчин
натрієвої солі гумінових кислот торфу (ТУ У 24.4-02012094-002-2001). Для
проведення досліджень за лабораторним регламентом із сертифікованого торфу
Івано-Франківського родовища (ТУ У 24.1-0549158-001-2001) були виготовлені: 0,1
% і 1 % розчини гумінату, 10 % та 20 % розчини сульфацил-гумінату [165].
Останній містить n - параамінобензол-сульфацетамід натрію і натрієві солі
гумінових кислот торфу, амінокислоти, мікроелементи (Деклараційний патент
України № 64624 А „Очні краплі” від 16.02.04. р.). В якості референтного
препарату використовували очні краплі – 10 % і 20 % сульфацилу натрію (ВАТ
«Фармак», Україна).
Нами проведено доклінічне вивчення цитотоксичності, антимікробної дії та
нешкідливості 20 % сульфацил-гумінату, а також його лікувальної ефективності
при моделюванні захворювань рогівки ока у кролів.
Фармакологічне дослідження 0,1 % розчину гумінату, 10 % и 20 % розчинів
сульфацил-гумінату проведено in vitro на моделі культури клітин і тест-штамах
мікроорганізмів, а також in vivo в умовах гострого і хронічного експериментів
на 14 морських свинках, масою 280-300 г, 137 кроликах породи шиншила, масою
1,8-2,2 кг, вирощених у розпліднику віварію ІОХіТТ. Всі тварини були
статевозрілі, обох статей, пройшли карантин і утримувалися на стандартному
раціоні віварію за встановленими нормами. Експерименти на піддослідних тваринах
проводились у відповідності до вимог біоетики. Обсяг експериментальних
досліджень представлено у табл. 2.1 і 2.2:
Таблиця 2.1
Обсяг експериментальних досліджень по вивченню цитотоксичної дії і
антимікробної активності сульфацил-гумінату та його складових in vitro
Назва дослідження
Дослідні розчини
Об’єкти тестування
Вивчення цитотоксичної дії
0,1 % і 1 % гумінат;
10 % і 20 %
сульфацил-гумінат;
10 % і 20 %
сульфацил натрію
Перещеплювана культура клітин нирок ембріону людини RH
Визначення антимікробної активності
0,1 % і 1 % гумінат;
10 % і 20 %
сульфацил-гумінат;
10 % і 20 %
сульфацил натрію
1. Staphylococcus aureus (золотистий стафілокок)
2. Pseudomonas aeruginosa (синьогнійна паличка)
3. Escherichia coli
(кишкова паличка)
4. Bacillus subtilis
(спороутворююча сінна паличка)
Таблиця 2.2
Обсяг експериментальних досліджень фармакологічних властивостей 20 %
сульфацил-гумінату
Назва дослідження
Вид тварин і їх кількість
Кількість очей
Виявлення місцево-подразнювальної дії та алергізуючих властивостей
Морські свинки
14
14
Кролики
14
14
Перевірка офтальмосприйнятності
Кролики
33
66
Вплив на епітелізацію рогівки (травматична ерозія)
20
40
Вплив препарату на регенерацію рогівки:
-травматичний кератит
-бактеріальний кератит
18
31
36
62
Гістологічні дослідження (курсове застосування, бактеріальний кератит)
Біохімічні дослідження
З них
42
21
+ 7 інтактних
42
28
Всього
Морські свинки - 14
Кролики -137
2.2. Визначення цитототоксичної дії сульфацил-гумінату
Експериментальна частина роботи виконана на базі лабораторії фармакології і
тканинної терапії ІОХіТТ ім. В. П. Філатова та кафедри мікробіології і
вірусології біологічного факультету ОНУ ім. І. І. Мечнікова. Висловлюю щиру
вдячність доценту кафедри, кандидату біологічних наук Т. В. Гудзенко за
консультативну допомогу у постановці даного досліду.
Як експериментальну модель використовували перещеплювану культуру клітин нирок
ембріону людини RH, яка відноситься до групи нормальних перещеплюваних клітин
та складається переважно з одно ядерних клітин епітеліоідного типу. Більшість
ядер містить 2-4 ядерця неправильної форми. Культура характеризується
гетероплоїдним набором хромосом, має високу проліферуючу здатність [61, 93,
166].
Для культивування даної культури клітин використовували середовище 199, яке
містить 10 % сироватки крові великої рогатої худоби. Посівна доза: 30-50 х 103
клітин/мл ростового середовища. Вирощували культури клітин у матрацах при
температурі 37°С. Пересів проводили через кожні 5-7 днів. Для цього після
видалення поживного середовища культуру клітин заливали підігрітим до 37°С
версеном (натрієвою сіллю етилендіамінтетраоцетової кислоти) так, щоб він
покривав шар клітин (8-10 мл). Розчин версену сприяє тонкому диспергуванню
клітин і не впливає на їхню життєздатність. Матрац з версеном витримували у
термостаті на протязі 10 хв. Після округлення клітин (контроль вели під
мікроскопом) версен зливали.
Суспензію клітин засівали у пеніцилінові 10 мл флакони з поживним середовищем
199. Через 24 години, тобто у логарифмічній фазі росту, добавляли до культури
клітин RH дослідні розчини по 0,1 мл у флакон. Флакони щільно закривали
пробками та поміщали в термостат при 37°С Кожне розведення зразків досліджували
тричі [93, 352].
Облік результатів проводили через 24, 48, 72, 144, 168 годин експозиції шляхом
візуальної оцінки цілісності моношару. Ступінь дегенерації моношару клітин
оцінювали за 4-х-плюсовою системою: дегенерація 75- 100 % клітин оцінювалась як
„++++”, від 50 до 75 % - „+++”, від 25 до 50 % - „++”, менше 25 % (зміна
морфології окремих клітин) – „+”, нормальний клітинний моношар оцінювався як
„-”.
Через 168 годин
- Київ+380960830922