ГЛАВА 2
Материалы и методы исследований
Опыты выполнены на 920 половозрелых белых крысах линии «Вистар» обоего пола
массой 160-200 г. В эксперимент животные брались после прохождения карантина в
течение 14 дней, которые находились на стандартной диете в условиях вивария
ЛГМУ и получали гранулированный корм по установленным нормам, доступ крыс к
воде был свободным.
Исследования проводили с учетом «Правил доклинической оценки безопасности
фармакологических средств (GLP)» [232]. Забой животных выполняли путем
декапитации в соответствии с «Методическими рекомендациями по выведению
животных из эксперимента» [233].
Экспериментальной моделью служил патологический процесс, развивающийся у
животных при раздавливании мягких тканей задних конечностей крыс в течение 5 ч
или 38,5 ч в специально сконструированном в лаборатории кафедры фармакологии
ЛГМУ станке-дозиметре с манометрическим контролем давления (15 кг/см2).
Скринингу подвергались потенциальные протекторы СДР из разных
фармакологических групп, способные воздействовать на одно или одновременно
несколько звеньев патогенеза изучаемого экстремального состояния: тиотриазолин
(«Фарматрон», Запорожье), пентоксифиллин, пирацетам, верапамил, фуросемид,
рибоксин (“Дарница”, Киев), ацелизин («Киевмедпрепарат», Киев), дипиридамол (ОЗ
ГНЦЛС, Харьков), цитохром-С, липин («Биолек», Харьков), неогемодез
(«Юрия-фарм», Киев), ацетилцистеин («Латвбиофарм», Латвия), а также среди
вновьсинтезированных в лаборатории кафедры фармацевтической химии Львовского
ГМУ канд. фарм. наук Р.Б. Лесиком соединений (Les1 - Les12) в ряду производных
2,4-тиазолидиндионов. Испытуемые препараты вводили внутрибрюшинно однократно,
непосредственно перед декомпрессией (компрессия в течение 5 ч), что обусловлено
условиями оказания медицинской помощи пострадавшим на догоспитальном этапе. При
выборе вводимых доз (не превышающих 0,1 LD50) препаратов также исходили из
многочисленных данных литературы и многолетнего опыта работы сотрудников
кафедры фармакологии ЛГМУ в области фармакокоррекции экстремальных состояний
гипоксического генеза [234-239].
Эффективность испытуемых препаратов в условиях моделируемой формы
компрессионной травмы оценивали по выживаемости животных, срокам их гибели и
клинической картине течения раннего посткомпрессионного периода в сравнении с
контрольной группой. С целью дополнительного подтверждения эффективности
наиболее активного (по результатам скрининговых исследований) препарата –
тиотриазолина, изучали его влияние на динамику маркера рабдомиолиза –
миоглобина, который определяли в сыворотке крови животных посредством реакции
пассивной гемагглютинации, оцениваемую на иммуноферментном анализаторе
АИФ-М/340, с помощью диагностикума эритроцитарного иммуноглобулинового сухого
миоглобина производства НПО «Диагностические системы» (Россия).
При разработке дозового режима тиотриазолин вводили внутрибрюшинно однократно,
в виде 2,5% водного раствора через 1 час от начала компрессии в дозах 50, 100,
150, 250, 300 (мг/кг). Продолжительность компрессии при этом составляла 38,5
часов. Эффективность вводимых доз препарата оценивали по среднему времени жизни
крыс в период компрессии, а также по их выживаемости. Математическое
моделирование процесса, описывающего влияния исследуемого лекарственного
средства на выживаемость и среднюю продолжительность жизни животных в условиях
СДР, осуществляли с использованием общепринятых математических приемов
интерполяции полученных экспериментальных данных, путем поиска такого
аналитического выражения, которое в максимальной степени корректно отражало бы
зависимость фармакологического эффекта от вводимых доз тиотриазолина. Анализ
функции и расчёт оптимальных доз проводили графически с помощью программы Mach
Engine V 2.001 для Pentium 200 MMX в среде Turbo Pascal V.7.0., содержащей
функции анализа, графики и линейной алгебры.
В последующих сериях эксперимента крысам опытной группы тиотриазолин вводили
однократно в виде 2,5% водного раствора внутрибрюшинно в установленной
оптимальной дозе (117,38 мг/кг) непосредственно перед декомпрессией. Все
исследования выполнялись в динамике: через 3, 6 и 24 часа после декомпрессии.
В качестве биосубстратов для проведения комплексных исследований в рамках
выполнения поставленных в настоящей работе задач, использовали сыворотку крови
и гомогенаты трех образований головного мозга – коры, гиппокампа и ствола,
образцы которых готовили на льду с использованием охлажденного (4оС)
изотонического раствора натрия хлорида.
Для исследования антирадикальной активности тиотриазолина на изучаемой модели
экстремального состояния использовали биохемилюминисцентный (БХЛ) метод, с
помощью которого регистрировали скорость протекания свободно-радикальных
реакций в анализируемых биосредах люминометром Emilite – 1105 фирмы «Био Хим
Мак» австро-германо-российского производства. Спектральный диапазон прибора –
350-950 нм, а диапазон измерений – 103 – 1010 фотон/с. В основу используемого
метода БХЛ положено измерение сверхслабого свечения, возникающего в результате
неферментативного аутоокисления ненасыщенных жирных кислот фосфолипидов,
реализующегося генерацией свободных радикалов, взаимодействующих с кислородом и
образующих пероксиды, которые рекомбинируя излучают кванты света. Для индукции
свободнорадикальных реакций был использован 3% раствор перекиси водорода по
методу, описанному Е.П. Сидориком и соавт. [240] с применением предложенных
сотрудниками кафедры фармакологии ЛГМУ усовершениствований [241]. При этом
оценивали следующие параметры БХЛ: амплитуду быстрой вспышки (I1
- Київ+380960830922