РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Для реалізації поставлених завдань обрано наступні методи дослідження:
- мікроскопія, визначення щільності популяцій бактеріальних угруповань,
виділення чистих культур мікроорганізмів, визначення адгезивних та
антагоністичних властивостей бактерій;
- різні методи ідентифікації мікроорганізмів;
- статистичні методи.
2.1. Загальна характеристика обстежених
Експериментальне дослідження проведено на 19 статевозрілих гвінейських свинках
масою 350-400 г. Згідно з європейською конвенцією про гуманне поводження з
лабораторними тваринами опік наносили під загальним ефірним наркозом водяною
парою при температурі 96-97 °С на епільовану поверхню шкіри свинки протягом 60
с. За таких умов розвивався опік ІІІА-Б ст. Площа ураження становила 18-20 %
поверхні тіла тварини. Забір мазків з рани проводився на 2, 7 та 21 добу.
Також з метою реалізації поставлених завдань вивчено і порівняно мікробіоценоз
опікової (ІІ-ІІІА-Б ст.) рани та аналогічної ділянки неушкодженої шкіри у 46
осіб віком від 1 до 67 років. Площа опіків становила до 15 % поверхні тіла.
Забір матеріалу проводився на 2-3 добу після отримання опікової травми,
повторний забір – на 7-8 добу після травми та на 19-21 добу. Окрему групу
склали 31 здорова особа (чоловіки – 11, жінки – 20) віком від 19 до 43 років.
Дослідження проводилися на базі опікового відділення Тернопільської міської
клінічної лікарні швидкої допомоги №1 та лабораторії мікробіологічних і
паразитарних досліджень кафедри медичної біології, мікробіології, вірусології
та імунології Тернопільського державного медичного університету
ім. І.Я. Горбачевського.
2.2. Штами мікроорганізмів, живильні середовища
Під час проведення мікробіологічних досліджень опікової рани та неушкодженої
шкіри виділено 810 штамів аеробних і факультативно анаеробних мікроорганізмів,
які належали до 12 родів, 31 видів. У всіх виділених культур вивчено
культуральні, морфологічні, тинкторіальні, біологічні та інші властивості
(продукція різних типів пігментів, каталази, оксидази, плазмокоагулази,
лецитинази, гемолізинів, окислення вуглеводів і спиртів, здатність відновлювати
нітрати в нітрити), чутливість до 17 антибіотиків, адгезивні властивості,
антагоністичні властивості до інших виділених з опікової рани штамів.
З метою дослідження мікробіоценозу шкіри людини застосували наступні живильні
середовища: м’ясопептонний агар (МПА), цукровий агар (1 % глюкозний МПА),
кров’яний агар (КА) для вивчення гемолітичних властивостей, жовтково-сольовий
агар (ЖСА) для ізоляції стафілококів та вивчення лецитиназної активності,
середовище Ендо для якісного і кількісного визначення ентеробактерій,
фуразолідоно-твіновий агар (ФТА) – для диференціації та кількісного обліку
мікрококів та коринебактерій, середовище Сабуро – для виділення грибів.
2.3. Методика дослідження мікрофлори шкіри
Для вивчення мiкробiоценозу шкiри використовували метод змивiв-зiскобiв
Williamson i Kligman (1965) в модифікації Климнюка С. І. та Ситника С. І.
(1995).
Дослiджувану дiлянку шкiри обмежували за допомогою скляного цилiндру з
відшліфованими краями і площею поперечного перетину 1,0 см2, притиснутого до
неї. У цилiндр вносили 1 мл 0,1 % розчину тритону Х-100 в фосфатному буферi,
молярна концентрація якого 0,075 моль/л, а потiм за допомогою спецiального
робочого елементу з насiчками проводили зiскоб мiкрофлори при помiрному
натискуваннi. Рiдину вiдсмоктували в стерильнi пробiрки, додавали в цилiндри ще
1 мл свiжого стерильного буферного розчину і повторювали процедуру. Обидвi
проби змiшували i готували десятикратні розведення в 0,05 % розчинi тритону
Х-100 в фосфатному буферi, молярна концентрація якого 0,075 моль/л, з метою
попередження агрегацiї бактерiй. Пiсля цього по 0,1 мл різних розведених проб
засiвали на живильні середовища КА, ЖСА, Ендо, Сабуро, ФТА та iнкубували при
оптимальнiй температурi 37 °С. Через 24-96 годин iнкубацiї пiдраховували
кiлькiсть колонiй і результат виражали числом колонiєутворюючих одиниць (КУО)
на 1 см2 площi шкiри за формулою:
Х = 20 ґ М ґ N, (2.1)
де Х – число КУО/см2,
20 – постiйний коефiцiєнт при посiвi 0,1 мл проби,
М – кiлькiсть колонiй, що виросли,
N – розведення (в 10, 100, 1000 разiв тощо).
Так як тритон Х-100 має незначну бактерицидну дію, проби висівали на живильні
середовища не пiзнiше 1 год пiсля забору матеріалу.
Враховуючи, що число мiкробiв на одиницю площi може сягати десятків тисяч,
використовували десятковий логарифм цього показника – lg КУО/см2.
2.4. Методика дослiдження мiкрофлори опікової рани
Забір проб здійснювали наступним чином: з поверхні опікової рани одноразовим
стерильним ватним тампоном забирали вміст. Використовувались одноразові ватні
тампони фірм Eurotubo (Іспанія) та Copan (Італія). До і після забору матеріалу
тампон зважували на торсійній вазі. Різницю маси приймали за кількість ранового
вмісту. Поміщали тампон в 1 мл 0,1 % розчину тритону Х-100 в фосфатному буферi,
молярна концентрація якого 0,075 моль/л, старанно струшували кілька хвилин.
Готували десятикратні розведення матеріалу, засівали на живильні середовища КА,
ЖСА, Ендо, Сабуро, ФТА, iнкубували при оптимальнiй температурi 37 °С. Через
24-96 годин iнкубацiї пiдраховували кiлькiсть колонiй і результат виражали
числом колонiєутворюючих одиниць (КУО) на 1 грам вмісту за формулою:
Х1 = 20хМхN/t, (2.2)
де Х1 – число КУО/г,
20 – постiйний коефiцiєнт при посiвi 0,1 мл проби,
М - кiлькiсть колонiй, що виросли,
N - розведення (в 10, 100, 1000 разiв тощо),
t –маса ранового вмісту, г.
Оскільки, число мiкробiв на одиницю маси може сягати десятків тисяч, кількість
мікроорганізмів у
- Київ+380960830922