РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Біологічний матеріал для проведення досліджень.
Робота виконувалась у 2002-2008 рр. в лабораторії біоконтролю агроекосистем
Інституту агроекології УААН.
Рослинний матеріал. Для дослідження взаємодії трансгенних рослин картоплі з
ґрунтовими мікроорганізмами використовували перспективні сорти картоплі
вітчизняної селекції – Бородянська рожева, Сєднєвська рання, Радич,
Чернігівська рання (Інститут мікробіології УААН, м. Чернігів) Билина, Загадка,
Червона рута (Інститут картоплярства УААН, с.м.т. Немішаєво), на основі яких
створювали трансгенні рослини даних сортів.
Бактеріальні культури. В дослідах з створення трансгенних рослин картоплі
використовували рекомбінантний бактеріальний штам Agrobacterium tumefaciens
pGV2260, в клітинах якого підтримувалась плазміда p35SGUSINT з послідовністю
ДНК інтроної ділянки в гені gus [105]. Штам A. tumefaciens GV2260 вирощували на
агаризованому середовищі Лурія Бертрані (LB) наступного складу: 10 г/л
бактотріптону, 5 г/л дріжджового екстракту, 10г/л NaCl, агар 15 г/л) або на
рідкому середовищі LB, які доповнювали відповідними концентраціями антибіотиків
(табл. 1), протягом 24 год при температурі 280С з аерацією, використовуючи
термостатичну качалку з круговими обертами (5 см, швидкість 150-200 об/хв). В
експериментах з вивчення ризиків горизонтального переносу генів використовували
штам Pseudomonas fluorescens 7769 з колекції відділу фітопатогенних
мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології ім.Д.К.Заболотного НАНУ.
Культура зберігалась на середовищі LB. Також в дослідженнях використовували
культуру Methylabacterium radiotolerans ІМБГ 290 з колекції відділу
регуляторних механізмів клітин Інституту молекулярної біології і генетики НАНУ,
яку зберігали на середовищі КВ [55] та Fusarium oxysporum (колекція Інституту
агроекології УААН).
Таблиця 2.1.
Бактеріальні штами використані в дослідженнях
Штам
Концентрації селективних речовин у поживному середовищі
P. fluorescens 7769
цефотаксим 100 мг/л
A. tumefaciens GV2260
рифампіцин 100 мг/л, канаміцин 100 мг/л
M.radiotoleransІМБГ 290
10 % гліцерин, метанол
2.2. Культивування мікроорганізмів та методи отримання трансгенних рослин
Визначення впливу умов культивування та гормонального складу поживних середовищ
на регенерацію пагонів з експлантів листків і міжвузль картоплі. Рослини
регенеранти з експлантів листків і міжвузль сортів картоплі отримували в
результаті субкультивування на поживних середовищах: А - на основі базового
середовища за Г.В. Рассадіною, 1988 [62], B – за В.А. Сідоровим, 1985 [60], C –
за В.А. Аветисовом, 1991 [22], D –модифіковане нами. Вегетативне розмноження
сортів картоплі в культурі in vitro проводили на середовищі МС за прописом
Мурашіге і Скуга [203, 39, 44].
Отримання бактеріальної культури Agrobacterium tumefaciens GV 2260 для
проведення генетичної трансформації тканин картоплі. Бактеріальні колонії A.
tumefaciens GV 2260 вирощували на агаризованому поживному середовищі АВ з
додаванням селективних агентів канаміцину і рифампіцину у концентрації 100 мг/л
і культивували у термостаті при температурі 280С, дві доби. Біомасу окремих
бактеріальних колоній Agrobacterium tumefaciens GV2260 брали з поверхні агару
стерильною загостреною паличкою і переносили в 5 мл рідкого середовища LB [33]
доповненого 100 мг/л канаміцину і 100 мг/л рифампіцину, для нарощування нічної
культури. Культивували 24 години на термостатичній качалці з круговими обертами
(амплітуда 5 см, швидкість 120 об/хв) при температурі 28єС. Суспензію
осаджували на центрифузі при 3000об/хв протягом 7 хв, осад ресуспендірували в
10 мл стерильного середовища МC до отримання бактеріальної суспензії для
інокуляції 108 кл/мл.
Прямий метод підрахунку клітин мікроорганізмів в камері Горяєва. Кількість
бактерій підраховували під мікроскопом при збільшенні х 400 у камері Горяєва М
851 за методичними вказівками [3]
Генетична трансформація тканин рослин картоплі (Solanum tuberosum L.) із
використанням A. tumefaciens. Для встановлення чутливості експлантів картоплі
до впливу умов культивування підчас і після трансформації, використано 5
варіантів контролів. У контролях досліджено вплив чинників на чутливість тканин
експлантів до: короткочасного культивування у рідкому середовищі; антибіотиків
цефотаксимому та канаміцину. Схема досліджень складалась:1) „сухий” контроль
(культивування умовах, що забезпечують утворення первинного калюсу;) 2)
„мокрий” контроль (інкубування експлантів протягом 15 хв у 20 мл рідкому
середовищі МС, із подальшим перенесенням на поживне середовище для утворення
первинного калюсу); 3) „мокрий” контроль, із додаванням на всіх етапах
культивування у поживне середовище антибіотику цефотаксим (500 мг/л); 4)
трансформація A. tumefaciens. Одна чашка Петрі містила від 5-10 біологічних
повторень як експлантів листків, так і сегментів стебла рослин картоплі.
Контрольні варіанти складалися з 4-х чашок Петрі, а варіанти трансформації – з
6-ти.
Експланти листків і міжвузль ізолювали із 3–4 тижневих рослин картоплі, які
вирощувались в умовах in vitro. На ізольованих експлантах картоплі робили
неглибокі надрізи і переносили їх в чашки Петрі де і проводили інкубацію їх
протягом 15 хв з суспензією нічної бактеріальної культури A. tumefaciens з
концентрацією 108 кл/мл [7]. Інкубацію контрольних рослин проводили в без
гормональному рідкому живильному середовищі МС протягом 15 хв. Після інкубації
в бактеріальній суспензії експланти обсушували стерильним фільтрувальним
папером для видалення надлишку бактерій і культивували спільно A. tumefaciens
на агаризованому середовищ
- Київ+380960830922