Содержание удельной радиоактивности в плазме крови определяли по формуле:
УР = А
где УР - удельная радиоактивность плазмы крови (имп/мин/см);
А - активность аликвоты (имп/мин).
5 Определение удельной радиоактивности в тканях мозга
Мозг взвешивали, гомогенизировали в см физиологического раствора, экстрагировали см этилацетата в течение мин. Гомогенат отделяли и повторяли экстрагирование этилацетатом. Всего экстрагирование проводили раза. Этилацетатные фракции объединяли, фильтровали через бумажный фильтр и отгоняли в роторном испарителе. Сухой остаток растворяли в см сцинтиллятора "Optifase", помещали в сцинтилляционные флаконы и через сутки измеряли радиоактивность на сцинтилляционном счетчике RackBeta- Spectral. Содержание удельной радиоактивности в тканях мозга определяли по формуле:
УР = А/m
где УР - удельная радиоактивность тканей мозга (имп/мин/см);
А - активность пробы (имп/мин);
m - масса мозга.
5 Определение содержания меченых соединений в плазме крови
Содержание меченых соединений в плазме крови определяли по формулам:
где С - концентрация меченых соединений (мкг/мл);
УР(пл) - удельная радиоактивность плазмы крови;
УР(цин) - удельная радиактивность циназепама;
УР(компл) - удельная радиоактивность комплекса циназепама с ?-циклодекстрином.
5 Определение содержания меченых соединений в тканях мозга
Содержание меченых соединений в тканях мозга определяли по формулам:
где С - концентрация меченых соединений (мкг/г);
УР(мозг) - удельная радиоактивность тканей мозга;
УР(цин) - удельная радиактивность циназепама;
УР(компл) - удельная радиоактивность комплекса циназепама с ?-циклодекстрином.
5 Определение продуктов биотрансформации циназепама и его комплекса с ?- циклодекстрином в экспериментах in vitro
В экспериментах использовали белых беспородных крыс-самцов, массой -г, которые содержались в стандартных условиях вивария при свободном доступе к корму и воде. Предварительно анестезированных крыс декапитировали, кровь собирали в гепаринизированные пробирки и сразу же центрифугировали при температуре -оС g минут. К см плазмы прибавляли циназепам (мг) или его комплекс с ?-циклодекстрином (эквивалентно мг циназепама) и инкубировали , , и мин в ультратермостате при оС, при постоянном перемешивании. Циназепам и продукты его биотрансформации экстрагировали из плазмы крови и тканей мозга этилацетатом, при соотношении биологическая жидкость-экстрагент : в течение мин. Всего провели цикла экстракции (х см), экстракты объединяли, отделяли от коэкстрагентов фильтрацией через бумажный фильтр "Белая лента", высушивали сульфатом натрия и упаривали до сухого остатка на роторном испарителе. Сухие остатки растворяли в 0.- см этилацетата, стеклянным капилляром наносили на пластинки "Silufol-UV " и хроматографировали в системе ацетон-хлороформ-гексан (::). Качественное детектирование циназепама и продуктов его биотрансформации проводили по величине Rf, форме и окраске пятен в УФ-свете либо в парах йода в присутствии метчиков циназепама, -ОН-феназепама и комплекса циназепама с ?-циклодекстрином.
Количественное определение соотношения циназепама и продуктов его биотрансформации осуществляли методом зонной хроматографии (по суммарной радиоактивности отдельных пиков). Пластинки
разделяли на зоны по , см, каждую зону вносили в сцинтилляционный флакон и заливали сцинтиллятором "Optifase" Через сутки определяли радиоактивность на сцинтилляционном счетчике RackBeta- Spectral.
Для изучения биотрансформации циназепама и его комплекса с ?-циклодекстрином в головном мозге предварительно анестезированных животных декапитировали, быстро выделяли головной мозг, промывали от остатков крови физиологическим раствором, просушивали фильтровальной бумагой, взвешивали и гомогенизировали в -ти кратном объеме физраствора в ручном стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком. В гомогенат вносили циназепам ( мг на см гомогената мозга) или его комплекс с ?-ЦД (эквивалентно мг циназепама) и инкубировали , , , и мин в водном термостате (оС) при постоянном перемешивании. Гомогенат головного мозга крыс переносили в делительные воронки, прибавляли -ти кратный объем этилацетата и экстрагировали при встряхивании мин. Экстракцию повторяли трижды. Экстракты объединяли и центрифугировали. Супернатанты упаривали в роторном испарителе досуха. Сухие остатки растворяли в 0.- см этилацетата и стеклянным капилляром наносили на пластинки "Silufol-UV " и хроматографировали в системе растворителей ацетон-хлороформ-гексан (::). Далее, как и в случае с плазмой крови, количественное определение соотношения циназепама и продуктов его биотрансформации определяли методом зонной радиохроматографии (по суммарной радиоактивности отдельных пиков). Пластинки
разделяли на зоны по , см, каждую зону вносили в сцинтилляционный флакон и заливали сцинтиллятором "Optifase" Через сутки определяли радиоактивность на сцинтилляционном счетчике RackBeta- Spectral.
5 Определение продуктов биотрансформации циназепама и его комплекса с ?- циклодекстрином в экспериментах in vivo
Изучение биотрансформации циназепама и его комплекса с ?-циклодекстрином в плазме крови и мозге крыс (in vivo) осуществляли при однократном пероральном введении крысам меченых и немеченых циназепама и его супрамолекулярного комплекса с ?-циклодекстрином состава :2.
С целью качественного определения циназепама и продуктов его биотрансформации in vivo в плазме крови и тканях мозга меченый циназепам или его комплекс с ?-ЦД вводили крысам перорально в виде Твиновой эмульсии. Через час предварительно анестезированных животных декапитировали, быстро собирали кровь в гепаринизированые пробирки, выделяли мозг. Циназепам и продукты его биотрансформации экстрагировали эилацетатом, экстракты в роторном испарителе упаривали досуха. Сухие остатки растворяли в 0.- см этилацетата и стеклянным капилляром наносили на пластинки "Silufol-UV ", хроматографировали в системе растворителей ацетон:хлороформ:гексан (::). Пластинки
разделяли на зоны по , см; каждую зону вносили в сцинтилляционный флакон и заливали сцинтиллятором "Optifase" Через сутки определяли радиоактивность на сцинтилляционном счетчике RackBeta- Spectral.
Аналогичные операции проделывали при пероральном введении немеченых циназепама и его комплекса с ?-циклодекстрином; детектирование и идентификацию продуктов биотрансформации осуществляли методом масс-спектрометрии. В УФ-свете предварительно определяли локализацию пятен
разделенных с помощью тонкослойной хроматографии соединений. Вместе со слоем силикагеля пятна с веществами извлекали с поверхности пластин и детектировали на масс-спектрометре МХ- с прямым введением образца. Энергия ионизации электронов еВ, температура источника оС, а также на масс-спектрометре VG , метод ионизиции - бомбардировка ускоренными атомами аргона, энергия пучка атомов аргона кэВ.
5 Статистическая обработка полученных результатов
Все эксперименты проводились в трех параллелях. Статистическую обработку и анализ полученных данных проводили с использованием вариационной статистики, определяя среднее арифметическое, среднее отклонение, с привлечением критерия Стьюдента и коэффициента достоверности Р. Расчеты линейной регрессии производили с помощью метода наименьших квадратов с использованием программы Excel 6.0. Данные представлены в виде ±?. Оценка значимых различий проводилась по следующим критериям:
- средний результат;
S - дисперсия;
S - стандартное отклонение отдельного результата;
Sx- стандартное отклонение среднего результата (среднеквадратичное);
Sr - относительное стандартное отклонение;
t? - критерий Стьюдента;
? - доверительный интервал;
±? - интервал среднего результата.
ВЫВОДЫ
1. Показано, что циназепам является частичным селективным агонистом центральных бенздиазепиновых рецепторов с величиной Кi , ± , нМ и значением ГАМК-индекса ,±,1. Методом радиолигандного анализа показано, что основной мишенью нейрохимического действия циназепама является ГАМКА-рецепторный комплекс ЦНС.
2. Обнаружены меньшие изменения величины ГАМК-сдвига после длительного введения циназепама в сравнении с зопиклоном, что свидетельствует о более медленном формировании толерантности к циназепаму, чем к зопиклону. Полное восстановление величины ГАМК-сдвига после отмены длительного ( дней) введения циназепама наступает через суток, что указывает на более мягкий характер его воздействия на ГАМКА-рецепторный комплекс в сравнении с другими гипнотиками.
3. Установлено, что длительное введение циназепама и зопиклона в разной степени изменяет аффинитет дофаминовых D- и D, серотонининовых -НТА, холецистокининовых ССК и периферических бенздиазепиновых рецепторов к их селективным лигандам. Наиболее существенные изменения наблюдаются в аффинитете дофаминовых D- и D рецепторов. Обнаружено, что длительное введение циназепама и зопиклона приводит к уменьшению величины Кі дофаминовых D-Р на % и %, соответственно. В случае D рецепторов после длительного введения циназепама происходит увеличение величины Кі на % относительно контроля, а зопиклона - уменьшение на %.
4. При пероральном введении циназепама в виде комплекса с ?-циклодекстрином повышается биодоступность и тканевая доступность (мозг) в , и , раза, соответственно, в сравнении с введением циназепама, что дает возможность рассмотреть его комплекс с ?-циклодекстрином как потенциальную лекарственную форму циназепама.
5. Установлено, что циназепам биотрансформируется в крови и в мозге с образованием основного метаболита -ОН-феназепама как in vitro, так и in vivo. В плазме крови циназепам медленнее биотрансформируется, чем в тканях мозга, независимо от формы его введения.
Список
- Київ+380960830922