РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ
2.1. Цитогенетичні дослідження
2.1.1. Експериментальні дослідження в умовах in vitro
Макрометод культивування лімфоцитів периферичної крові людини. Матеріалом для
цитогенетичних досліджень були лімфоцити периферичної крові дорослих, клінічно
здорових донорів Приготування культури лімфоцитів здійснювали за модифікованим
методом Moorchead et al. [143], який коротко полягає в наступному.
Еритроцити осаджували 10%-ним розчином желатину. Після опромінення (у всіх
дослідах опромінювали нестимульовані лімфоцити, тобто плазму з лейкоцитами
після осаджування еритроцитів) лімфоцити культивували в поживному середовищі
RPMI 1640 (Москва) з фітогемаглютиніном (PHA-P, «Difco», США) в герметичних
флаконах протягом 50-52 год (останні 2 год – з колхіцином, «Merk», Німеччина),
що дозволило аналізувати клітини в першому післярадіаційному мітозі. Після
гіпотонічної обробки (0,075 М розчином KCl) і трьохразової фіксації (3 частини
етанолу і 1 частина льодяної оцтової кислоти) готували препарати метафазних
пластинок шляхом крапання суспензії клітин на знежирені заморожені предметні
скельця і випалювання над полум'ям пальника. Препарати гідролізували в 5 N HCl
при кімнатній температурі (15 хв.), а потім відмивали.
Фарбування препаратів здійснювали 2%-ним розчином барвника Гімза («Merk»,
Німеччина), приготовленого на 0,07 М фосфатному буфері (рН 6,8). Отримані
цитогенетичні препарати шифрували й аналізували за «сліпим» методом.
Цитогенетичний аналіз і класифікація аберацій хромосом. Аналіз традиційно
пофарбованих хромосом виконували з візуальним груповим каріотипуванням. У своїй
роботі при відборі метафазних пластинок для аналізу хромосом ми дотримувались
критеріїв, які полягають в наступному.
Усі хромосоми повинні бути чітко пофарбовані і рівномірно розподілені у
пластинці, причому так, щоб кожну з них можна було добре розгледіти і
ідентифікувати за груповою приналежністю. У разі накладення однієї на іншу,
форми обох хромосом і їх центроміри повинні бути добре вираженими. Ступінь
спіралізації хромосом повинен забезпечувати чітке виявлення хроматид і
центромір усіх без виключення хромосом (рис. 2.1). Багаторічний досвід
радіаційно-цитогенетичних досліджень показує, що дотримання вказаних вимог при
виборі метафазних пластинок дозволяє підвищити точність реєстрації структурних
порушень хромосом і зменшити суб’єктивний фактор при їх ідентифікації [18, 19,
26, 48 та ін.].
Рис. 2.1.
Мікрофото метафазної пластинки, яка придатна для аналізу аберацій хромосом.
Користуючись загальноприйнятою класифікацією, ми враховували аберації
хроматидного (обміни, делеції, ізоделеції) і хромосомного (парні фрагменти,
точки, ацентричні кільця, дицентрики, центричні кільця, транслокації або
аномальні моноцентрики) типів (рис. 2.2 і 2.3). Пропуски не включали в число
аберацій. Критерієм відмінності пропусків від фрагментів служив зсув останніх
щодо осі хромосоми [159]. Застосований метод фарбування хромосом не дозволяє
Рис. 2.2 Схема (а) і мікрофото (б) аберацій хроматидного типу: 1 – пропуск; 2 –
одиночний фрагмент; 3 – ізохроматидна делеція (парний фрагмент); 4 –
симетричний обмін; 5 – асиметричний обмін (цит. з [18]).
Рис. 2.3 Схема (а) і мікрофото (б) аберацій хромосомного типу: 1 – парний
фрагмент; 2 – точки (інтерстиціальні делеції); 3 – ацентричні кільця; 4 –
центричне кільце; 5 – аномальна хромосома (акроцентрик); 6 – дицентрик (цит. з
[18]).
коректно диференціювати перицентричні інверсії і симетричні хромосомні
транслокації, внаслідок чого їх відносили до одного класу – перебудовані
(аномальні) хромосоми. При традиційному фарбуванні клітин повністю врахувати
даний тип аберацій було неможливо, і в результаті ми реєстрували тільки частину
їх: якщо транслокація відбувалася на довгому плечі акроцентричної хромосоми і
транслокована ділянка була довше за вихідну; якщо перебудована хромосома мала
плечі, що перевищують за величиною довгі плечі хромосоми 2 (найдовші в
каріотипі) або близькі до їхньої довжини при наявності обох хромосом 2 у
каріотипі.. При аналізі результатів трицентрик враховували як два дицентрики і
т.д.; точки й ацентричні кільця поєднували в один клас, бо вони є результатом
одного процесу – інтерстиціальної делеції, тільки при створенні ацентричного
кільця делетується більша ділянка хромосоми. Далі, при аналізі аберацій
хромосом до дицентрика і центричного кільця відносили по одному парному
фрагменту, які є результатом злиття двох ацентричних фрагментів, тобто вони є
складовою частиною обмінної перебудови.
Оскільки ізохроматидні фрагменти не відрізняються морфологічно від парних
фрагментів хромосомного типу, то останні реєстрували як ізохроматидні делеції
тільки у випадках просторової близькості з ушкодженою хромосомою.
Ми аналізували тільки метафази, які містили 45-47 хромосом. Згідно даних
літератури [18], метафази з меншим числом хромосом можуть бути наслідком
механічного пошкодження у процесі приготування цитогенетичних препаратів. Такий
підхід до відбору метафаз виключає вірогідність недообліку променевих маркерів
– дицентриків, які найчастіше зустрічаються у спектрі аберацій хромосом при
опроміненні нестимульованих (G0-стадія) лімфоцитів.
Всього було проаналізовано 194 тисяч метафаз, у середньому по 300-400 метафаз
на експериментальну точку і по 200-300 метафаз для кожного пацієнта, що
відповідає необхідним вимогам [363].
Всі етапи цитогенетичних досліджень, пов'язані з культивуванням лімфоцитів,
одержанням якісних цитогенетичних препаратів, метафазним аналізом аберацій
хромосом, виконані особисто дисертантом.
Умови опроміненн