РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Об‘єкт і матеріали досліджень
Експериментальна частина роботи виконана на норках, песцях, шиншилах, великій
рогатій худобі, вівцях, ооцитах і доімплантаційних ембріонах, які одержували
від живих та евтаназованих тварин.
Дослідних тварин використовували як донорів-ембріонів та реципієнтів в
естральний і анестральний періоди у господарствах „Гряда” Жовківського району,
селянської спілки “Кам‘янка” Кам’янко-Бузького району, звірогосподарствах
„Бартатівське” Городоцького та „Галичхутро” Сокальського районів Львівської
області. Дослідження виконували в умовах господарств і лабораторії клітинної
інженерії Львівського філіалу Інституту розведення і генетики тварин УААН та
Інституту біології тварин УААН протягом 1991-2002 років. Окремі дослідження
виконані за участю спеціалістів лабораторії біотехнології відтворення Інституту
біології тварин УААН, кафедри загальної хірургії Львівської Національної
академії ветеринарної медицини ім. С.З.Гжицького та кафедри розведення овець і
кіз Краківської аграрної академії ім. Х.Коллонтая (Польща).
Досліджували видові особливості доімплантаційного ембріонального розвитку
хутрових тварин кліткового утримання, зокрема норок, песців і шиншили;
гормональну регуляцію процесів оо- і ембріогенезу in vivo та за умов
застосування біотехнологічних методів in vitro, формування
ембріонально-маткового сигналу у тварин з різною ембріопродуктивністю.
Вивчали можливості застосування мікрохірургічних методів для реконструкції
ембріонів тварин, зокрема, утворення ембріональних химер норок з бластомерів
синхронного і асинхронного розвитку та відновлення міжклітинних з‘єднань в
химерних ембріонах корів електрошоком. Встановлювали умови реініціації
мітотичного дроблення в половинках розморожених ембріонів корів за участю
фідерних клітин ембріонального і маткового походження з одержанням ембріонів
2-ої генерації, їх мікрохірургічного поділу і подальшого розвитку чверток in
vivo після трансплантації телицям-реципієнтам. Узагальнювали можливості
отримання сета ідентичних тварин з групи ембріональних клітин (чверток
розморожених ембріонів), з обмеженою кількістю тварин у клоні до 4-х.
Розробляли умови підвищення морфологічної якості ооцитів модельних (норок,
песців, шиншил) і сільськогосподарських тварин (корів, овець) за рахунок їх
культивування in vitro у модифікованому середовищі, до складу якого входили
біологічно –активні речовини, зокрема гормони та амінокислоти, у певних
концентраціях. Удосконалювали технологію запліднення in vitro ооцитів овець зі
застосуванням запропонованого нами середовища для дозрівання ооцитів корів і
овець.
В залежності від умов і задач досліджень були сформовані відповідні групи
тварин, ооцитів та ембріонів. Середовища, що використовували у дослідженнях,
були вибрані на основі попередніх експериментів з даних літератури [99, 128].
Дослідження виконували за загальною схемою (рис.2.1).
2.2. Методи одержання і трансплантації ембріонів хутрових тварин
Норки, песці та шиншили були використані як модельні об’єкти вивчення
механізмів раннього ембріонального розвитку, одним з аспектів якого є видові
особливості їх оо- і ембріогенезу. Це спонукало до відпрацювання нами низки
методів, зокрема: визначення якості сперми
самців, загальної анестезії самиць-донорів і реципієнтів, одержання і
трансплантації ембріонів ранніх стадій.
2.2.1. Визначення якості сперми самців норок. Дослідження проводили в період
гону на самицях та самцях стандартного темно-коричневого (Standart-St) і
сріблясто-голубого (Silver-blue - Bl) генотипів.
Для запобігання недоодержання ембріонів від норок-донорів, перевірку самців на
якість сперми здійснювали загальновідомим методом: очною піпеткою з піхви щойно
спарованої самиці брали одну краплю еякуляту, переносили на предметне скло,
покривали покривним скельцем, оцінювали під мікроскопом за густиною і кількістю
живих сперміїв [61]. Внаслідок порушення технології взяття сперми або
потрапляння сечі в еякулят її оцінка може бути необ’єктивною. Для визначення
якості сперми самців норок додатково використовували метод визначення
інтенсивності дихання сперміїв за знебарвленням метиленової синьки, який
полягає у змішуванні 0,01% розчину метиленової синьки у 0,9% розчині натрію
хлориду з еякулятом (1:1) і візуальної оцінки інтенсивності поглинання кисню
сперміями (табл.2.1).
Таблиця 2.1
Схема досліджень з визначення якості сперми самців норок
Групи тварин
Метод визначення якості сперми самців норок
Контрольна
Візуальна оцінка мазків з піхви спарованої самиці
Дослідна
Визначення інтенсивності дихання сперміїв за знебарвленням метиленової синьки
2.2.2. Евтаназія та загальна анестезія хутрових тварин. Для одержання ооцитів,
яйцеклітин та ранніх доімплантаційних ембріонів від норок, песців та шиншил
здійснювали евтаназію тварин. Для цього застосовували 2% розчин дитиліну, який
містить 10 мг дійодметілат діметиламіноетинолового ефіру янтарної кислоти і
володіє яскраво вираженою курареподібною дією (група міорелаксантів).
Внутрім‘язове введення дитиліну у ділянку стегна в дозі 0,25 мл на 1 кг живої
маси викликало у тварин параліч дихання.
Зважаючи на малі розміри репродуктивних органів самиць (норок і шиншил), значну
кількість внутрішнього жиру, який огортає яйцепроводи і яєчники (норок і
песців), що ускладнюють процедуру прижиттєвого вимивання ембріонів, їх зручніше
одержувати від евтаназованих тварин. Однак, в експериментах з хірургічної
трансплантації ембріонів (норок, песців) або хірургічного при