РОЗДІЛ 2
МЕТОДИ ТА ОБ'ЄКТ ДОСЛІДЖЕННЯ
Дисертаційна робота включає 2 частини - експериментальну й клінічну. Експериментальні дослідження виконано у центральній науково-дослідній лабораторії Тернопільської державної медичної академії ім. І. Я. Горбачевського. Необхідність їх проведення зумовлюється відсутністю у літературі даних про застосування досліджуваних нами методів лікування та вплив їх на оптимізацію структурно-функціональних взаємин на клітинному і міжклітинному рівнях та нормалізацію стану шкіри.
Методи експериментальних досліджень.
Дослідження було виконано на 186 статево дозрілих щурах-самках віком 8-10 міс., масою тіла 160-180 г, які утримувалися на стандартному раціоні віварію. Усіх піддослідних тварин було поділено на такі групи: І - інтактні (6 щурів); ІІ - тварини з постоваріоектомічним синдромом (яким оперативним шляхом видалили матку з придатками, 30 щурів); ІІІ - тварини з постоваріоектомічним синдромом, яким проводили лікування "Естрожелем" (30 щурів); IV - тварини з постоваріоектомічним синдромом, яким проводили лікування "Клімадиноном" (30 щурів); V - тварини з постоваріоектомічним синдромом, яким проводили лікування "Клімадиноном" та "Естрожелем" (30 щурів); VI - тварини з постоваріоектомічним синдромом, яким проводили лікування "Клімадиноном", "Естрожелем" та "Вобензимом" (30 щурів), VІІ - тварини, з постоваріоектомічним синдромом, яким проводили лікування "Овестином" та "Флуренізидом" (30 щурів).
Препарат естрожель фірми "Besing-Iscoveco" наносили на шкіру спини, на якій попередньо видаляли шерсть, у дозі 35 мкг/кг, що відповідає 0,021 мкг 17-? естрадіолу з 8-ї доби післяопераційного періоду. Для розрахунку щоденної дози використовували пластмасовий шпатель-дозатор, який додається до препарату.
"Клімадинон" фірми "Bionorica" використовували у вигляді розчину для прийому всередину. Спиртовий препарат розводили у 50 разів дистильованою водою і вводили внутрішньошлунково зондом із розрахунку 1 мл/кг, що відповідає 0,4 мг/кг екстракту кореня цимицифуги протягом всього експерименту. Інтактнi тварини отримували ідентичний об'єм 0,9 % розчину етанолу.
Препарат системної ензимотерапії "Вобензим" вводили внутрішньошлунково зондом з розрахунку 1/4 таблетки на 1 кг маси тіла щура протягом всього терміну експерименту.
"Овестин" вводили інтравагінально в дозі, що відповідає 10 мкг/кг естріолу з 14-ї доби після оперативного втручання протягом 15 днів, "Флуренізид" - з розрахунку 1,4 мг/кг з 20-ї доби протягом 10 днів.
Операція екстирпація матки з придатками: в асептичних умовах здійснювали розріз черевної стінки пошарово довжиною 3-4 см, проводили екстирпацію матки з трубами та яєчниками. Після цього рану черевної стінки ушивали окремими вікриловими швами і обробляли 3 % спиртовим розчином йоду.
Дослідження проводили через 24 год, 7, 14, 30 та 45 діб від моменту проведення операції. Після експериментів проводили евтаназію тварин методом швидкої декапітації під тіопенталовим наркозом.
2.1. Оцінка активності процесів ліпопероксидації
2.1.1. Метод визначення дієнової кон'югації ненасичених вищих жирних кислот.
Принцип методу базується на тому, що у процесі переокислення ліпідів в молекулах субстратів, які окислюються, утворюються споріднені подвійні зв'язки [392]. При цьому з'являється максимум у спектрі поглинання оптичного випромінювання при довжині хвилі 233 нм.
У центрифужні пробірки наливаємо по 1 мл плазми чи 10 % гомогенату і 9 мл екстрагуючої суміші гептану з ізопропіловим спиртом у співвідношенні 1:1. Отриману суспензію центрифугуємо 10 хв. 4000 об./хв. Надосадову рідину зливаємо і додаємо дистильованої води у співвідношенні 1:10, струшуємо і відсмоктуємо гептанову фазу в об'ємі 0,5 мл. Після цього додаємо етиловий спирт в об'ємному співвідношенні 1:5 і визначаємо оптичну щільність при довжині хвилі 233 нм. В якості контролю використовуємо фосфатний буфер (рН 7,6). Концентрацію дієнових кон'югат розраховуємо, виходячи із коефіцієнту молярної екстинкції, що дорівнює 2,2 ·10-5 моль-1 · см-1.
2.1.2. Визначення вмісту гідропероксидів ліпідів (ГПЛ).
Вміст ГПЛ визначали за методом В.Б. Гаврилова, М.И. Мишкорудной [393], який ґрунтується на тому, що екстраговані гептан-ізопропіловою сумішшю гідропероксиди мають відповідний максимум поглинання при ?= 233 нм.
До 0,2 мл плазми або 10% гомогенату додавали 4 мл суміші гептан-ізопропанолу (1:1) і струшували 15 хв. на лабораторному струшувачі АВ-30. Потім у пробірки додавали по 1 мл розчину НСІ (рН=2,0) і 2 мл гептану, інтенсивно струшували і після відстоювання та розшарування суміші (через 30 хв) відбирали гептановий шар і вимірювали його оптичну щільність на спектрофотометрі СФ-46 при ?=232 нм. Як контроль використовували пробу, яка містила 0,2 мл дистильованої води замість досліджуваного матеріалу. Розрахунок вмісту ГПЛ проводили у відносних одиницях за формулою:
С= 10?Е?V1/V2 , (2.1)
де Е - оптична щільність гептанового шару проби, V1 - кінцевий об'єм гептанового екстракту (4 мл), V2 - об'єм досліджуваного матеріалу (2 мл).
Вміст ГПЛ виражали в умовних одиницях екстинкції (ум.од.), у плазмі в ум.од/мл плазми.
2.1.3. Метод визначення концентрації ТБК-активних продуктів.
Концентрацію ТБК-активних продуктів визначали за методом И.Д. Стальной, М.Г. Герашвили [392]. Принцип методу полягає у здатності малонового діальдегіду при взаємодії з тіобарбітуровою кислотою в кислому середовищі утворювати забарвлений комплекс, інтенсивність якого пропорційна вмісту ТБК-активних продуктів. Дослідження проводили у плазмі.
У звичайні центрифужні пробірки наливаємо по 1 мл дистильованої води, 1 мл 10% гомогенату або 0,5 мл плазми, 2 мл 30% р-ну трихлороцтової кислоти, 0,2 мл 5 М HСl, 2 мл тіобарбітурової кислоти і витримуємо 15 хв на водяній бані при 100 ?С. Проби охолоджували, осад відділяли центрифугуванням при 3000 об.