Розділ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
У обстежуваних хворих на тяжкі та хронічні розповсюджені дерматози (псоріаз, атопічний дерматит, акантолітична пухирчатка) проводилось визначення показників пептидів середньої молекулярної маси в плазмі крові, сорбційної здатності еритроцитів, показника сигма-ШОЕ (електроседиментаційного потенціалу) крові, вмісту гідроперекисів ліпідів і малонового діальдегіду в плазмі крові, дослідження активності супероксиддисмутази в еритроцитах, визначення кількості Т- та В-лімфоцитів в крові, циркулюючих імунних комплексів, вмісту імуноглобулінів А, G, Е і М в сироватці крові, показників реакції бласттрансформації лімфоцитів, дослідження активності мієлопероксидази, сукцинатдегідрогенази, лужної та кислої фосфатаз в клітинах крові, визначення кількості загальних ліпідів, тригліцеридів, ?-ліпопротеїдів в плазмі крові.
Визначення пептидів середньої молекулярної маси в плазмі крові проводили за методом Н.И. Габриэлян [109]. Плазму крові обробляли 10% розчином трихлороцтової кислоти, співвідношення плазми і кислоти 1:0,5. Просвітлення досягалось центрифугуванням при швидкості 3000 обертів на хвилину на протязі 30 хвилин. Детекцію надосаду, вивільненого від грубодисперсних білків, здійснювали після попереднього розведення, при якому до 0,5 мл надосадної рідини додавали 4,5 мл дистильованої води. Вимір проводили на спектрофотометрі Спектромом 204 в ультрафіолетовому світлі при довжині хвилі 254 нм. Показник пептидів середньої молекулярної маси виражався в одиницях, еквівалентних показнику екстинції.
Для визначення ступеня ендотоксикозу за методом сорбційної здатності еритроцитів [459] з вени брали 4 мл крові в пробірку, яка містить в собі 1 мл 3,8% розчину цитрату натрія, змішували і відділяли еритроцити шляхом центрифугування на протязі 10 хвилин при 3000 обертах на хвилину. Переносили 1 мл еритроцитарної маси в пробірку, яка містить в собі 3 мл 0,025% розчину метиленового синього, приготовленого на фізіологічному розчині. Перемішували і інкубірували на протязі 12 хвилин при кімнатній температурі. В подальшому центрифугували на протязі 10 хвилин при 3000 обертах на хвилину. Надосадну рідину переносили в кювету фотоелектроколориметра. Визначали оптичну щільність вихідного розчину та надосадної рідини в одиницях екстинції колориметричним методом по відношенню до фізіологічного розчину. При роботі на фотоелектроколориметрі користувались червоним світлофільтром. Кількість поглинутого барвника в процентах розраховували за формулою:
А(%) = 100 -,
де: А - кількість поглинутого барвника (в %);
В - оптична щільність вихідного розчину (в одиницях екстинції);
С - оптична щільність розчину барвника після інкубації з еритроцитами
хворого (в одиницях екстинції).
Показник сигма-ШОЕ (електроседиментаційний потенціал) крові визначали по Вестергрену за методом Т.Д. Никулы и соавт. [319]. В дві центрифужні пробірки, які містять в собі по 0,1 мл гепарина, вносили по 5 мл (2,5 мл) венозної крові досліджуваного. Після центрифугування першої пробірки при 3000 обертах на хвилину 15 хвилин, визначали показник гематокриту (гематокрит - кількість еритроцитів поділена на кількість крові).
Визначив показник гематокриту, розраховували кількість плазми крові (в мл), яку необхідно додати в дослідну другу пробірку або витягти з неї для стандартизації гематокриту в дослідній пробірці за формулою:
для чоловіків: СГ = () · Х,
для жінок: СГ = () · Х,
де: СГ - показник стандартизації гематокриту (кількість плазми крові в мл,
яку треба додати в дослідну пробірку або витягти з неї);
Г - показник гематокриту в досліджуваного;
X - вихідний об'єм крові в дослідній пробірці (5мл або 2,5 мл).
Для спрощення розрахунків використовували складені спеціальні таблиці, в яких приведені вже розраховані показники об'єму плазми крові, який необхідно додати в дослідну пробірку або витягти з неї для стандартизації гематокриту в дослідній пробірці при визначенні показника сигма-ШОЕ (електроседиментаційного потенціалу) крові.
В відповідності з таблицею або результатом, отриманим за допомогою вищенаведеної формули, з першої (центрифужної) пробірки переносять в другу (дослідну) або відбирають з неї відповідний об'єм плазми (для стандартизації гематокриту).
В другу пробірку додавали 4% розчин цитрату натрію з розрахунку 0,1 мл цитрату натрію на кожний мл крові зі стандартним гематокритом. Вміст другої пробірки ретельно перемішували, після чого з неї набирали кров в капіляр Вестергрена до відмітки 0. Встановлювали цей капіляр строго вертикально в штатив, відмітивши час. Враховували абсолютні величини еритроседиментації (в мм) через 20-30-40 та 50 хвилин. Сума перших чотирьох цифр і є величина показника сигма-ШОЕ (електроседиментаційного потенціалу) крові в мм.
Для визначення вмісту гідропероксидів ліпідів використовували спосіб екстракції їх із плазми крові сумішшю гептан-ізопропанол за методом В.Г. Гаврилова, М.И. Мишкорудной [111]. Метод оснований на властивостях ліпідів з подвійними зв'язками і кетоновими групами поглинати ультрафіолетові промені з довжиною хвилі 233 нм. Величина оптичної щільності при 233 нм кількісно відповідає вмісту гідроперекисів ліпідів. До 0,2 мл плазми додавали 4мл суміші гептан-ізопропанол (1:1) та струшували 10-15 хвилин. Далі додавали 1 мл соляної кислоти з рН 3,0 та 2 мл гептану інтенсивно струшували та центрифугували при 3000 обертах за хвилину 10 хвилин. Відбирали дуже акуратно гептановий шар та вимірювали оптичну щільність отриманого дослідного розчину при довжині хвилі 233 нм на спектрофотометрі Спектромом 204. В контрольній пробі замість плазми брали 0,2 мл дистильованої води. Розрахунок проводили на 1 мл плазми в відносних одиницях за формулою:
?233= або 20 · Е,
де: ?233 - показник вмісту гідроперекисів ліпідів;
Е - виміряне значення оптичної щільності дослідної проби (в одиницях екстинції);
4 мл - кінцевий об'єм гептанового екстракту;
0,2 мл - об'єм досліджуваної плазми крові.
- Київ+380960830922