СОДЕРЖАНИЕ
Введение Глава I.
Принципы работы Фурье масс-анализаторов. Программное обеспечение, использовавшееся для моделирования динамики ионных ансамблей внутри масс-анализаторов.
1.1. Устройство ИЦР-ПФ масс-анализатора.
1.2. Устройство масс-анализатора орбитальная ионная ловушка.
1.3. Описание алгоритма и его реализации в использовавшемся программном обеспечении
Глава II. Моделирование динамики ионов в ловушках ИЦР-ПФ масс-анализаторов.
2.1. Стабилизация ионных облаков в ИЦР-11Ф масс анализаторе
2.1.А. Разрушение ионных облаков при ангармоническом электрическом удерживающем поле, аппроксимация электростатического поля ИЦР-ПФ ловушки
2.1.Б. Разрушение ионных облаков в неоднородном магнитном поле ИЦР ловушки
2.1.В. Механизм стабилизации ионных облаков в негармоническом электрическом и неоднородном магнитном поле, эмпирические зависимости
2.2. Слияние ионных облаков в скрещенном электрическом и магнитном полях
2.2.А Эмпирические зависимости для минимального количества ионов, необходимого для слияния двух ионных облаков разного т/х
2.2.Б Переход ионных облаков с близким т/х из связанного дрейфом состояния в свободное и из свободного состояния в связанное
2.2.В Слияние ионных облаков для изотопного кластера белка Цитохром С, зарядовое состояние +23.
2.3 Исследование стабильности ионных облаков в ИЦР-ПФ масс-анализаторах при столкновениях ионных облаков друг с другом.
2.4 Определение динамического диапазона ИЦР-ПФ масс-анализаторов с учетом эффектов, вызванных ион-ионным взаимодействием.
3-19
20-37
20-28
28-30
31-37
38-89
39-65
40-45
45-54
55-64
66-84
65-72
72-81
81-83
84-88
88-89
2
Глава III. Моделирование динамики движения ионов в масс- 90-103
анализаторе орбитальная ионная ловушка
3.1 Исследование стабильности ионных облаков в масс-анализаторе орбитальная ионная ловушка при столкновениях ионных облаков друг с другом.
3.2 Динамика ионных облаков в орбитальной ионной ловушке при неидеальном удерживающем электростатическом поле
3.2.А Динамика ионных облаков в случае ангармоничности удерживающего электростатического поля,' вызванного конечными размерами ловушки
3.2.Б Сдвиги частот колебаний ионных облаков при разном количестве зарядов в ионных облаках для орбитальной ионной ловушки
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ЛИТЕРАТУРА
Введение
Масс-спектромстрия - инструментальный метод в аналитической химии, используемый для анализа вещества путем определения массы (чаще, отношения массы к заряду т/т) и относительных количеств ионов, получаемых при ионизации и/или фрагментации молекул исследуемого вещества. Масс-спектрометрия используется для определения элементного состава и химической структуры молекул и смесей [1].
При масс-спектрометрическом анализе осуществляется ионизация вещества с целью получения заряженных молекул или их фрагментов и последующее определение их масс по характеру движения полученных ионов в электрическом иУили магнитном полях [2,3].
Характерный эксперимент в масс-спектрометрии включает [4,5]:
1. ввод анализируемого образца в прибор;
103-104
104-113
94-95
96-103
96-99
99-102
3
2. ионизацию компонентов образца одним из доступных методов для получения заряженных молекул;
3. движение ионов в электрических и магнитных полях анализатора масс;
4. взаимодействие ионов с системой детектирования;
5. анализ полученных сигналов.
Рассмотрим детально каждый шаг.
Способ загрузки анализируемой смеси в прибор определяется выбранным для нее методом ионизации. Измерение масс в масс-спектрометрии основано на определении характера движения ионов в электрических и магнитных полях, поэтому для масс-
спектрометрического анализа исследуемое вещество должно быть переведено в газообразную фазу и ионизировано [4]. В настоящее время при исследованиях биологических молекул наиболее распространены следующие методы “мягкой” ионизации: ионизация с помощью электроспрея (elcktrospray ionization ESI) [6] и матричноактивированная лазерная десорбция/ионизация (МЛДИ) (matrix-assisted laser desorption/ionization. MALDI) [7,8,9]. Первый из методов предназначен для ионизации веществ, находящихся в жидкой форме, поэтому его удобно использовать совместно с жидкостными методами разделения компонентов вещества, например, совместно с жидкостной хроматографией. Второй основан на возгонке и ионизации образца из сухой кристаллической матрицы лазерными Импульсами [1,4,9,10,11]. Оба метода не разрушают межатомные связи белковых макромолекул, что принципиально для возможности использования их при ионизации и измерении масс белков или пептидов [10,11,12]. Появление указанных методов ионизации привело к существенному распространению масс-спектрометрических методов в биомедицинских науках [1], что было отмечено присуждением Нобелевской премии по химии за 2002 год Дж.Фенну и К. Танака. [4, 13].
При определении структуры молекул (например аминокислотной последовательности) часто используется измерение не только массы молекул, но и измерение масс фрагментов молекул, полученных в результате фрагментации [5,12,14]. Фрагментация молекул может происходить как на этапе ионизации, так и после нее. Для того, чтобы осуществить фрагментацию белков и пептидов были разработаны различные методы. Основные из них: Диссоциация, вызнанная
столкновением ионов с нейтральными частицами (collision-induced
4
dissociation. CID); фрагментация, вызванная захватом низкоэнергетических электронов (electron capture dissociation. ECD); фотодиссоциация инфракрасным или ультрафиолетовым лазером. [5,12,14,16,17,18]
После ионизации ионы но системе транспорта перемещаются в масс-анапизатор, где в том или ином виде происходит определение их масс. Если говорить более точно, масс-анализагор позволяет измерять отношение m/z массы ш иона к его заряду z, при этом масса молекул в данном случае может быть определена при интерпретации масс-спектра целиком, поэтому термин «масса» часто употребляется синонимично с m/z [2,19].
Разделение ионов по величине m/z может быть основано на различных принципах, однако в нашей работе мы будем рассматривать только масс-анализаторы с преобразованием Фурье, в которых не происходит пространственного или временного разделения ионов с разным m/z, а сигнал для ионов разного m/z записывается одновременно.
Исторически первым масс-ан ал и затором, в котором было применено одновременное детектирование сигнала от ионов разных m/z с Фурье преобразованием сигнала, стал анализатор ионного циклотронного резонанса (ИЦР-ПФ, FT-ICR). В основу конструкции масс-анализатора ионно-циклотронного резонанса с Фурье преобразованием сигнала положена ловушка Пенинга. Ловушка Пенинга - это устройство для удержания заряженных частиц с помощью однородного магнитного и постоянного пространственно неоднородного электрического поля [15,20].
Масс-спектрометрия ИЦР-ПФ возникла и стала развиваться после пионерских работ американских исследователей А. Маршалла и М. Комисарова [21,22,23]. Масс-анализатор представляет собой ловушку, в которой ионы удерживаются электрическим и магнитным полями. Цикл измерения масс-спектра с помощью масс-анализатора ИЦР-ПФ включает в себя процесс синхронного увеличения радиуса орбиты циклотронного движения ионов после их инжекции в ловушку масс-анализатора за счет возбуждения циклотронного движения радиочастотным полем на частоте циклотронного резонанса и процесс детектирования токов, наводимых движением ионов. К полученному в ходе детектирования сигналу применяется преобразование Фурье, что позволяет получить частотный спектр, по которому после калибровки по ионам известной массы можно определить m/z.
5
Значение исследований в области разработки методов удержания заряженных частиц в ионных ловушках Пауля и Пеннинга отмечено вручением Нобелевской премии в 1989 г В. Паулю и работавшему параллельно с ним X. Г. Дельмету [ 15,24].
Однако, обладая рекордным разрешением и точностью измерения масс, метод ИЦР-ФП не лишен некоторых недостатков, среди которых самым главным является необходимость использования для создания магнитного поля криомагнитов с относительно высокими (3 Тесла и выше) магнитными полями, что приводит к высоким эксплуатационным расходам при обслуживании магнитов. Поэтому большой интерес также представляет другой тип Фурье масс-спектрометров - орбитальная ионная ловушка (огЫп-ар, орбитрэп), изобретенная относительно недавно [25,26,27,28]. Орбитальная ионная ловушка приближается по своим характеристикам к ИЦР-ФП приборам, использующим ячейки без динамической гармонизации[29]. Приборы использующие ионные ловушки типа “орбитрэп”, получили широкое распространение благодаря работам Макарова который реализовал орбитальный подход к удержанию ионов, предложенный ранее Кингдоном [30].
Орбитрэп состоит из внешнего бочкообразного электрода и коаксиального с ним внутреннего, имеющего форму веретена. В орбитрэпе используется только статическое электрическое поле; к центральному электроду приложен постоянный отрицательный потенциал, и между внешним и внутренним электродами образуется симметричное статическое электрическое поле. Ионы вводятся В орбитрэп перпендикулярно центральному электроду и начинают совершать вокруг него вращение по сложной траектории. Движение в плоскости полярных координат (р.Ф) и вдоль оси прибора г можно
считать независимыми. Частота колебаний иона вдоль оси инструмента обратно пропорциональна квадратному корню от величины т/г и таким образом, не зависит от его положения и энергии, а значит, может быть использована для определения массы [25]. Детектирование в орбитальной ионной ловушке осуществляется следующим образом. В простейшем случае внешний электрод сегментируется на две части плоскостью, перпендикулярной оси z. Регистрируемый сигнал определяется переменной плотностью индуцированных на сегментированном электроде поверхностных зарядов, вызванных аксиальными колебаниями ионов.
6
Обозначения и термины.
Масс-спсктр - это двумерное графическое представление интенсивности сигнала от различных масс [3]. Исходный детектируемый сигнал может иметь различный вид, но в конечном счете его преобразуют в масс-спектр. Во времяпролетных масс-спектрометрах исходным сигналом является гистограмма регистрации различных ионов, достигнувших детектора в различные моменты времени. В масс-спектрометрах с преобразованием Фурье (ИЦР-ПФ, орбитальная ионная ловушка) исходный сигнал - это зависимость величины заряда, наведенного на детектирующих пластинах, от времени. В этом случае для получения масс-спектра сначала необходимо выполнить преобразование Фурье, чтобы получить Фурье спектр сигнала, а затем перейти от шкалы частот к шкале масс [31], однако иногда вместо преобразования Фурье используют другие преобразования сигнала (метод фильтрации-диагонализации ФДМ[32,33], линейная аппроксимация с разложением Холецкого [34]). Частотный спектр является дискретным и часто возникает проблема определения массы по пикам, для чего разрабатываются специальные методы интерпретации спектров[35]. Высоту самого интенсивного пика обычно принимают за единицу и соответствующим образом нормируют весь спектр. В некоторых случаях интенсивность пиков на масс-спектре можно сопоставить с относительным содержанием ионов каждой массы [19].
В масс-спектрометрии массы принято выражать в атомных единицах массы ( а.е.м.). За одну атомную единицу массы принимают
1 1 л
■— массы изотопа углерода С. Однако гораздо чаще вместо слов
«атомная единица массы», используют термин «дальтон» (Да, Оа). Массы больших молекул измеряют в кило (1кДа=103 Да) и мегадальтоиах (1МДа=10° Да). Итак, 1 а.е.м.= 1 Да=1.6605402 • 10 27 кг [3,15,19]. Заряд г (или ц) в масс-спектрометрии обычно выражают в единицах элементарного заряда: ц=е, где е= 1.60217733 ' 10'19 Кл это заряд электрона. Для безразмерной величины т/ъ некоторые авторы используют внесистемную единицу «Томсон» (ТЬошбоп) 1ТЬ= 1 И а/е [1,3,19,36]. (В данной работе в случае, когда для т/г не указанна единица измерения - используется Томсон, например ш/г=500 означает т/г=500 а.е.м./с).
В зависимости от метода ионизации ион может быть, например, положительным радикалом (М+ •)> например протонированным ([М +
Н]*) или депротонированным ионом ([М - Н]). Поэтому массу
7
электрона или протона необходимо учитывать при нахождении массы молекулы по значениям m/z из масс-спектра [2,3].
Точность измерения массы (mass accuracy) отражает отличие между измеренным и действительным или теоретическим значениями. Как правило, точность рассматривается в применении к ионам, имеющим единичный заряд [М + Н]+. Точность может быть определена как абсолютная погрешность измеренной массы: если теоретическая масса иона [М + Н]+ составляет ш, и в эксперименте получена величина т±Дт, то точность равна Дт. Однако, говоря о точности, чаще подразумевают относительную погрешность, которая определяется как
— абсолютной погрешности Am к значению т, которое принимается т
за истинное. Относительная погрешность является величиной безразмерной, и обычно выражается в миллионных долях (parts-per-million, ppm). Например, если теоретическая масса иона [М 4- Н]+ равна 1000 Да, а измеренная масса оказалась равной 1000.2 Да, то абсолютная погрешность равна 0.2 и точность измерения массы составила
0.2X1000-^200 10'6, или 200ррт. В сверхточных измерениях
относительную погрешность выражают также в миллиардных долях ( ppb). [37]
Разрешение выражает способность масс-спектрометра различать ионы с близкими массами [3]. Разные авторы определяют разрешение различными способами [19], но в масс-спектрометрии чаще пользуются определениями, предложенными А. Маршаллом [15]. Разрешение (resolution) - это ширина спектрального пика на половине его высоты: Дсо 50% в частной области и Дт 50% на шкале масс. Разрешающая способность (resolving power) - это отношение измеренной величины к ширине ее спектрального пика: о>/ Дсо 50% для частот и m/Дт 50% для масс [15]. Однако такое определение имеет недостаток, который проявляется в тех случаях, когда при малой ширине суммарного пика два пика являются неразрешенными [38]. Среди прочего, стоит отметить, что высокое разрешение бывает необходимо при определении зарядового состояния ионов вещества по его изотопному кластеру для ионов с большим количеством зарядов. Например, изотопные пики иона [М + Н]~ с зарядом +1 отстоят друг от друга на 1,0: для иона [М + 2Н]т2 с зарядом +2 эта величина составляет 0.5: для [М + ЗН]+3 с зарядом +3 1/3: и т. д. [1].
8
Эффекты, влияющие на аналитические характеристики масс-анализаторов.
Для анализа сложных химических смесей, таких как нефть, гуминовыс вещества, физиологические жидкости человека в последнее время широко используется масс-спектрометрия[1,39,40,41]. Исследование таких смесей с помощью масс-спектрометрии предъявляет высокие требования к аналитическим характеристикам используемых масс-спектрометров: разрешению, динамическому
диапазону и точности измерения масс[40].
Самое высокое разрешение и точность достигаются, в масс-анализаторах с преобразованием Фурье (ионный циклотронный резонанс, орбитрэп). Масс-анализаторы с преобразованием Фурье требуют для высокого разрешения как можно более продолжительных сигналов токов, наводимых движением ионов в детектирующей электрической цепи. Длительность таких сигналов составляет от десятков миллисекунд до нескольких минут.
В таких ловушках ионы совершают миллионы циклов колебаний в ограниченном пространстве ионной ловушки-детектора, а пробег внутри таких масс-анализаторов составляет десятки километров. При этом происходит многократное пересечение траекторий ионных облаков разного т/г, поэтому кулоновское взаимодействие существенно влияет на их поведение, и, как следствие на аналитические характеристики. Исследование поведения ионных ансамблей с помощью численного моделирования, учитывающего кулоновское взаимодействие, дает возможность наблюдать многие из эффектов, определяющих разрешение, динамический диапазон и точность измерения масс, которые необходимо учитывать при конструировании новых приборов.
Делались неоднократные попытки теоретического исследования указанных эффектов. Оно представляет немалые трудности, так как для единственного иона аналитическое- решение представляется затруднительным по причине нелинейности полей ловушек, а для условий реального эксперимента кроме того требуется решать задачу многих тел. Например Я. Наито и М. Иноуэ теоретически исследовали явление слияния спсклральных пиков двух близких масс. В предложенной модели с целью упрощения рассмотрения не учитывались аксиальные колебания ионов и магнетронное движение. В предположении малости размеров ионных облаков по сравнению с их циклотронными радиусами ионные облака рассматри вались как
9
- Київ+380960830922