СОДЕРЖАНИИ
1. ВВЕДЕНИИ................................................................
1.1. Актуальность темы...................................................
1.2.1Іели и задачи исследования..........................................
1.3. Научная новизна.....................................................
1.4. Практическая значимость работы и реализация результатов исследований ............................................................
1.5. Апробация работы....................................................
1.6. Публикации..........................................................
1.7. Основные положения диссертационной работы, выносимые
на защиту................................................................
1.8. Объем и структура диссертации.......................................
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ........................................................
2.1. Морфологическая и физико-химическая характеристика вирусов оспы овец И ОСПЫ коз.....................................................
2.2. Эпизоотическая обстановка по оспе овец и оспе коз...................
2.3. Патогенез оспы овец и оспы коз и клиническое проявление болезни .
2.4. Антигенная взаимосвязь между каприпоксвирусами......................
2.5. Родство каприпоксвирусов с другими представителями семейства Poxviridae...............................................................
2.6. Генетическое родство каприпоксвирусов...............................
2.7. Диагностика оспы овец и оспы коз....................................
2.7.1. Вирусологические методы исследований............................
2.7.2. Серологическая и ретроспективная диагностика ООиОК..............
2.7.3. Молекулярно - генетические методы...............................
2.8. Заключение по обзору литературы.....................................
3. СОБСТВЕІП1ЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ...............................................
3.1. Материалы...........................................................
3.1.1. Вирусы..........................................................
3.1.2. Животные........................................................
3.1.3. Культуры клеток.................................................
3.1.4. Питательные среды и добавки к ним...............................
3.1.5. Сыворотки.......................................................
3.1.6. Реактивы......................t.................................
3.1.7. Исходные водные растворы........................................
3.1.8. Оборудование....................................................
3.2. Методы..............................................................
3.2.1. Получение и титрование вируссодержашего материала...............
3.2.2. Электронная микроскопия.........................................
3.2.3. 1 Іолучение гибридом, продуцирующих МА к ВОО....................
3.2.5. Получение специфических антисывороток...........................
3.2.6. І Іриготовленис очищенных иммуноглобулинов G....................
3.2.7. І Іостановка PI I для титрования антител........................
3.2.8. Определение концентрации белка..................................
3.2.9. Коныогирование моно- и поликлональных IgG с Г1Х.................
..8
..8
..9
10
11
11
11
12
12
13
13
14
17
18
20
21
23
24
29
32
35
36
36
36
36
37
38
39
39
41
43
44
44
45
45
48
48
49
49
49
3
3.2.10. Лиофилизация биологических материалов......................50
3.2.11. Методы статистической обработки данных.....................50
3.3. Результаты собственных исследований.............................50
3.3.1. Определение чувствительных культур клеток к ВООиОК..........51
3.3.2. 11олучение специфических антигенов ВООиОК...................53
3.3.2.1.11олучение очищенного препарата вируса.....................53
3.3.2.2. Получение частично очищенного препарата вируса............55
3.3.2.3. Получение нормального и специфического культурального антигенов........................................................55
3.3.2.4. Получение специфического органо-тканевого антигена........56
3.3.3. Изучение антигенного родства ВООиОК в серологических реакциях.........................................................56
3.3.3.1. Определение антигенного родства вирусов оспы овец и оспы коз в реакции нейтрализации с постоянным разведением сыворотки.......56
3.3.3.2. Изучение антигенных взаимоотношений вирусов оспы овец и оспы коз в реакции диффузионной преципитации.....................57
3.3.4. 11олучение моноклональных антител...........................58
3.3.4.1. Иммунизация мышей и контроль иммунного ответа.............59
3.3.4.2. Гибридизация клеток.......................................59
3.3.4.3. Разработка методов скрининга МА, специфичных к антигенным детерминантам вирусов оспы овец и оспы коз.......................60
3.3.4.3.1. Разработка непрямого метода твердофазного ИФА...........60
3.3.4.3.2. Разработка непрямого метода гистохимического ИФА........62
3.3.4.3.3. Разработка модифицированной реакции нейтрализации для скрининга вируснейтрализующих антител............................63
3.3.4.4. Тестирование специфической антителопродукции линий гибридных клеток.................................................64
3.3.4.4.1. Результаты скрининга МА непрямым методом ТФ ИФА.........64
3.3.4.4.2. Результаты скрининга МА непрямым методом ГХ ИФА.........64
3.3.4.4.3. Результаты скрининга вируснейтрализующих МА.............65
3.3.4.5. Клонирование гибридных клеток.............................65
3.3.4.6. Получение асцитических жидкостей..........................65
3.3.4.7. Очистка и контроль активности МА..........................65
3.3.4.8. Изучение свойств моноклональных антител...................66
3.3.4.8.1. Определение класса и подкласса М А......................66
3.3.4.8.2. Определение активности МА непрямым методом ТФ ИФА....66
3.3.4.8.3. Определение активности МА непрямым ГХ ИФА...............66
3.3.4.8.4. Определение активности МА в PH..........................67
3.3.4.8.5. Определение активности МА в реакции диффузионной преципитации.....................................................67
3.3.4.8.6. Изучение свойств МА методом иммуноэлектронной микроскопии......................................................67
3.3.4.8.7. Определение полипептидной специфичности МА..............69
3.3.5. Получение поликлональных антител............................70
13
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Морфологическая и физико - химическая характеристика вирусов оспы овец и оспы коз
Оспа овец и оспа коз - контагиозные вирусные болезни, характеризующиеся лихорадкой, поражением эпителиальных клеток кожи и слизистой оболочки с образованием папулезной сыпи [16, 17,44, 137].
Вирусную этиологию оспы овец установил в 1803 г. французский исследователь ВоггсИ А. [59]. Впервые оспу коз, как самостоятельное заболевание описал Нап$$еп в 1879 г. [125].
Возбудителями данных болезней являются двухцепочечные ДНК - содержащие вирусы, относящиеся к роду Сарпрохуди$ семейства Рохмпбае [77, 78, 107, 123].
При электронном ми крое копирован ии обнаруживаются вирионы двух видов - кирпичеобразной формы, размером 250-300 х 150-200 \ 100 нм и округлой формы, размером 320 х 200 нм [10, 39, 97]. имеющие сложное строение. Вирион состоит из центральной части - нуклеоида. овальных боковых тел и наружной оболочки. Нуклеоид содержит ДНК. связанную с белком, и окружен оболочкой сердцевины толщиной 5 нм. Боковые тела как бы сдавливают нуклеоид, придавая ему форму двояковогнутого диска. Нуклеоид и боковые тела окружены наружной оболочкой, состоящей из липидов и полых трубчатых белковых структур - филаментов. которые у каприпоксвирусов располагаются в разных направлениях [38. 47, 123].
Плавучая плотность вирионов в растворе сахарозы составляет 1.25 г/см', в СбО - 1,3 г/см ' 1123]. В составе их обнаружено более 100 полипептидов [60].
ВООиОК инактивируются 2%-ным раствором фенола; чувствительны к эфиру, формалину, щелочи. Устойчивы при pH окружающей среды от 3 до 9. Температура свыше 55 С приводит к быстрой инактивации вирусов. Однако минусовые температуры и высушивание сохраняют их жизнеспособность до
14
2 лет. Выживаемости ВООиОК (до 4-5 лет) способствуют белковые субстраты (сухие оспенные корочки, лимфа), которые являются естественными стабилизаторами для вирионов [30,47].
Кроме вирусов оспы овец и коз к этому роду относится вирус модулярного дерматита КРС (бугорчатки КРС, болезнь Нетлинга) (ВИД КРС) [107,
2.2. Эпизоотическая обстановка по оспе овец и оспе коз
На сегодняшний день оспа овец и оспа коз широко распространены в странах Азии, Африки, Ближнего и Среднего Востока (112], причиняя экономический ущерб, слагаемый из гибели больных животных (от 5-10 % при доброкачественной форме течения и до 50-80 % при осложнении с е кун дар-ной инфекцией), рождения мертвых или нежизнеспособных ягнят, снижения мясной и шерстной продуктивности, а также из затрат на проведение охран-но - карантинных и ветсринарно - санитарных мероприятий [12. 13, 16,- 17. 44. 51, 137]. Вспышки оспы овец также отмечены в странах Европы [112).
В нашей стране крайне неблагополучная обстановка по оспе овец сложилась в период Великой Отечественной войны и послевоенные годы [30]. Однако, с разработкой и внедрением в практику в 50-ых годах гидроокись алюминиевой формолвакцинм эпизоотии оспы мелких жвачных были приостановлены [128].
Начиная с 1983 по 1987 гг. спорадические вспышки оспы овец регистрировались на Дальнем Востоке, в южных областях Казахстана, республиках Средней Азии, Грузии (19, 26, 47].
После непродолжительного периода благополучия оспа овей была установлена в декабре 1994 года в Дагестане (5 неблагополучных пунктов), затем в Ставропольском крае (5 неблагополучных пунктов). В них заболело 2807 овец, из них 1459 пало. После этого болезнь быстро начала распространяться по югу России и Северному Кавказу [48, 112] (Таб. 1). Лишь проведение в этих регионах массовой иммунизации всего восприимчивого поголовья
- Киев+380960830922