2
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
дАТФ - дезоксиаденинтрифосфат
дГТФ - дезоксигуанинтрифосфат
дЦТД - дезоксицитозинтрифосфат
дТТФ - дезокситиминтрифосфат
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
ИФА - иммуноферментный анализ
КР - кольцевая реакция с молоком
м.к. - микробные клетки
п.н. - пар нуклеотидов
ГІДРФ - полиморфизм длины рестрикционных фрагментов
ПЦР - полимеразная цепная реакция
РА РАВС реакция агглютинации реакция агглютинации с вагинальной слизью
РБП - роз бенгал проба
РДСК - реакция длительного связывания комплемента
РИД - реакция иммунодиффузии
РКОА - реакция коагглютинации
РНАТ - реакция нейтрализации антител
РНК - рибонуклеиновая кислота
рРНК - рибосомальная РЫК
РДСК - реакция длительного связывания комплемента
РСК - реакция связывания комплемента
т.п.н. - тысяч пар нуклеотидов
тРНК - транспортная РНК
л
:>
ОГЛАВЛЕНИЕ
Стр.
Список сокращений..................................... 2
Введение............................................. 6-12
1. Обзор литературы..................................... 12-74
1.1. Бруцеллез............................................ 12-47
1.1.1. Краткая историческая справка......................... 12-15
1.1.2. Характеристика возбудителя бруцеллеза................ 14
1.1.2.1 Таксономия........................................... 14
1.1.2.2. Геном................................................ 15-16
1.1.3. Краткий анализ эпизоотической ситуации по бруцеллезу 16-19
1Л .4. Резервуар и источники бруцеллезной инфекции 19
] Л .5. Диагностика бруцеллеза животных...................... 20
1.1.5.1. Серологические методы диагностики бруцеллеза 21
1Л .5.2. Аллергическая диагностика бруцеллеза................. 33
1Л .5.3. Бактериологическая диагностика бруцеллеза............ 33-34
1.1.5.4. Молекулярно-генетическая диагностика бруцеллеза 34-47
1.2. Кампилобактериоз..................................... 47-74
1.2.1. Краткая историческая справка......................... 47-48
1.2.2. Характеристика возбудителя болезни................... 48
1.2.2.1. Таксономия........................................... 48-49
1.2.2.2. Морфологические свойства............................. 49
1.2.2.3. Культуральные свойства............................... 49-51
1.2.3. Эпизоотология заболевания............................ 51-57
1.2.4. Диагностика кампилобактериоза животных............... 57-71
1.2.5. Идентификация кампилобактерий........................ 71-74
1.3. Анализ обзора литературы............................. 74-88
2. Собственные исследования............................. 89-184
2.1. Материалы и методы...................................... 89-102
2.1.1. Подготовка исследуемого материала.................... 91
2.1.2. Выделение геномной ДНК из исследуемого материала ... 91 -93
2.1.3. Постановка ПЦР....................................... 93
2.1.4. Очистка ампликонов методом фенольной экстракции ... 93-94
2.1.5. Рестрикционный анализ................................ 94
2.1.6. Электрофоретический анализ........................... 95-96
2.1.7. Изучение свойств кампилобактерий..................... 96-101
2.2. Результаты собственных исследований.................. 101
2.2.1. Разработка ПЦР-тест-системы для выявления бруцелл 101 -140
2.2.1.1. Краткое теоретическое обоснование основных принципов при разработке ПЦР-тест-систем............................... 101-104
26
Аналогичные результаты были получены М.И. Чернышевой с соавторами при серологическом исследовании больных и экспериментально зараженных северных оленей (134).
По данным Скрашевской Е.И., с помощью РИГА, в сравнении с другими серологическими тестами, удается дополнительно выявить на 30% больше больных животных (147).
Renoux G. et al. считают, что РНГА специфична, чувствительна и может быть использована и при диагностике бруцеллеза, вызванного атипичными штаммами бруцелл. Кроме того, она позволяет обнаруживать наличие гемагглютининов в сыворотках крови телят, полученных от бруцеллезных коров, дающих отрицательный результат в РА (137).
Большая работа по разработке бруцеллезного антигена для РНГА и РНАТ выполнена Садыковым С.Ж., который в итоге предложил антиген для сенсибилизации эритроцитов барана, полученный путем экстрагирования бруцелл, суспендированных в ацетатном буфере, при температуре 110-115 °С в течение 30 минут (142, 143).
Изучение специфичности и чувствительности РНГА при бруцеллезе людей, крупного рогатого скота, овец и лабораторных животных, проведенное и другими исследователями, показало значительное превосходство РНГА над РА, РСК, реакцией Хеддельсона и другими реакциями (4, 11, 52, 53,63, 62, 80, 92, 93,94, 138,186, 148, 119).
Хаировым С.Г. разработана новая технология изготовления, стандартизации и контроля бруцеллезного эритроцитарного антигена для РНГА. При производстве антигена предложено использовать вакцинный штамм В. abortus. Стандартизация антигена проводится с использованием национальной стандартной сыворотки Anti-Brucella abortus, что позволяет изготавливать стандартные серии антигена, не отличающиеся друг от друга по активности.
В процессе разработки антигена было установлено, что его специфич-
27
ность и активность определяются способом получения сенситина. Оптимальным признано экстрагирование сенситина из бактериальной суспензии культуры бруцелл в 12 % растворе хлорида натрия при 120 °С с последующей обработкой алкилсульфатом натрия.
Согласно результатом исследований, РНГА с данным антигеном позволяет выявлять больных животных в большем количестве и в более ранние сроки, чем РБП, РА, РСК и РДСК вместе взятые.
Достоверность результатов исследований сыворотки крови в РНГА подтверждена результатами бактериологического исследования материала от этих же животных.
По мнению автора, внедрение в ветеринарную практику PHI’А как основного серологического метода диагностики бруцеллеза животных, позволит повысить эффективность диагностических исследований, сократить материальные и трудовые затраты за счет уменьшения расходов на основные компоненты многочисленных серологических реакций (167).
Кольцевая реакция с молоком
Впервые кольцевая реакция с молоком (КР) для исследования дойных коров на бруцеллез была предложена Fleichauer О. (247).
В результате многочисленных исследований установлено, что кольцевая реакция с молоком является специфичным и чувствительным методом диагностики бруцеллеза у животных с острым и хроническим течением инфекции и может применяться для контроля благополучия дойных стад по бруцеллезу (25, 33,85, 87, 97, 98, 105, 112, 125, 156).
Триленко П. А. провел сравнительное изучение чувствительности и специфичности КР с молоком и других серологических методов и сделал вывод, что эта проба по количеству положительных реакций приближается к результатам исследования в РА и РСК (162).
Согласно данным Логинова Ф.С., пробы молока от 34,8 % коров, сыворотка крови которых была исследована в РСК с положительным результа-
- Київ+380960830922