РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ
2.1. Объекты исследования.
Объектами исследования в данной работе являлись одно- и мультицепочечные гомополинуклеотиды (табл. 2.1). Лиофилизированные препараты нуклеиновых кислот растворяли в буфере до необходимой концентрации (10-5-10-4М), которую определяли по коэффициенту молярной экстинкции в максимумах поглощения (табл. 2.1) с ошибкой 0.5%. При измерении ДУФС р = (1?0.1)?10-4М, а в опытах по плавлению полинуклеотидов р = (4.0?0.5)?10-5М. Средняя длина полинуклеотидов составляла ~200 триплетов и ~1000 пар оснований для A?2U и A?U, соответственно.
Таблица 2.1.
Объекты исследования
ВеществоПоложение максимума ?мах ,nmЭкстинкция в максимуме
?, M-1cм-1ИзготовительPolyA25710000Serva, GermanyPolyU2619600Serva, GermanypolyA?polyU2607400Sigma, USA polyA?2polyU2605600Sigma, USA PolyI24810000Sigma, USA
Большинство измерений выполнено в ацетатном буфере, имевшем рН 6.0: при такой кислотности, как показывают расчеты [64], количеством комплексов ионов Mg2+, Cа2+, Mn2+ с анионами буфера можно пренебречь. В случае A?U и A?2U часть измерений была проведена в какодилатном буфере с рН 7.0, так как при значениях рН близких к 6 происходит конформационный переход polyA, что может затруднить интерпретацию полученных результатов.
Для получения четырехцепочечной polyI готовили раствор с высокой ионной силой. Для этого в ацетатном буфере (10-3 М Na+, рН 6.0) растворяли NaCl до получения концентрации Na+ 1М, при этом рН раствора сохранялась. В полученном буфере растворяли одноцепочечную polyI и выдерживали в течение 300 часов при 20С. Образование упорядоченной структуры контролировали по гипохромному эффекту и по увеличению кооперативности перехода спираль - клубок. Поскольку в условиях высокой ионной силы polyI с течением времени частично переходит в мультиспиральную конформацию, для получения одноцепочечного образца свежерастворенную polyI нагревали до 960С, а затем быстро охлаждали до комнатной температуры.
Ионы металлов вводились в раствор полинуклеотидов в виде хлоридов. Используемые соли квалификации х.ч. (CuCl2, NiCl2, MgCl2, MnCl2, CaCl2) были дважды перекристаллизированы. Концентрация ионов определяли во весу и контролировали методом трилонометрического титрования с использование соответствующих индикаторов [76]. Ошибка определения концентрации добавляемых ионов не превышала 0.5%.
Для приготовления растворов использовался деионизированный дистиллят, приготовленный на установке "Super Q" фирмы Millipore (США), имевший остаточную электропроводность менее 0.1 ?S. Для уменьшения содержания примесей металлов использовали кварцевую и полиэтиленовую посуду.
2.2. Экспериментальные методы
2.2.1. УФ-спектроскопия. Основным методом, использованным в настоящей работе, является УФ- спектроскопия.
Спектры поглощения в видимой и ультрафиолетовой областях обусловлены переходами молекулы из основного в возбужденное электронное состояние, которые сопровождается поглощением света с частотой ? [77]. Для НК и их компонентов наибольший интерес представляет диапазон ближнего ультрафиолета 50000 > ? > 30000 см-1, соответствующий ???* и n??* переходам. Мерой интенсивности поглощения служит молярный коэффициент экстинкции (?), определяемый законом Ламберта-Бера [78]:
(2.1)
где А/ - оптическая плотность раствора I0 и I - соответственно интенсивность падающего и прошедшего через раствор света, p - молярная концентрация полимера (или отдельных мономеров), d - толщина поглощающего слоя.
Величина ? связана с основной характеристикой электронного перехода - силой осциллятора (f) - соотношением [77]:
(2.2)
где интеграл берется по всей области поглощения, относящейся к данной полосе.
Значение f вычисляется методами квантовой механики [77 -79]:
f0a = ?0a?0a2 (2.3)
где е и me - заряд и масса электрона, ?0а - частота перехода с начального уровня 0 на возбужденный уровень а, ?0а - дипольный момент, индуцированный светом (момент перехода).
Взаимодействие моментов перехода приводит к гипо- или гиперхромизму оптического поглощения. В этом случае в окрестности частоты ?0а, при взаимодействии данного электронного перехода (0?а) одного хромофора со всеми более высокоэнергетическими переходами (0?b, 0?c) других хромофоров суммарная интенсивность в области перехода 0?а может измениться. Величина этого эффекта обратно пропорциональна кубу расстояния между взаимодействующими хромофорами и зависит от их взаимного расположения. В стопочной структуре, характерной для упорядоченных полинуклеотидов, поглощение чувствительно к изменению угла между плоскостями и не чувствительно к поворотам одного хромофора в плоскости, параллельной плоскости другого. Последнее обстоятельство приводит к тому, что УФ-спектроскопия мало чувствительна к конформационным переходам, при которых сохраняется двухспиральная конформация. Однако эффект, обусловленный разрушением (или образованием) регулярной структуры, составляет 10-50% начального поглощения, что делает УФ спектроскопию наилучшим методом для изучения переходов типа спираль-клубок.
Количественной характеристикой гиперхромизма является гиперхромный коэффициент
(2.4)
где ?? - изменение поглощения полимера при переходе спираль-клубок. ???*-переходы поляризованы в плоскости оснований, поэтому при образовании стопки хромофоров из-за взаимного отталкивания диполей момент перехода поглощающих хромофоров уменьшается и соответственно уменьшается поглощение (гипохромизм). Для n??*-переходов моменты расположены коллинеарно и при образовании стопки поглощение, соответствующее этим переходам, увеличивается (гиперхромизм). При разрушении стопочной структуры эффекты об