РОЗДІЛ 2
ОБ'ЄКТ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Відбір тварин для дослідження та експериментальні моделі
Досліди проведено на 515 білих нелінійних статевозрілих щурах-самцях, які
утримувалися на стандартних світловому, харчовому та температурному режимах
віварію.
Розподіл тварин на ВС і НС до гіпоксії проводили за методикою
В.Я. Березовського [18]. При індивідуальних дослідженнях кожну тварину поміщали
в барокамеру, у якій за допомогою електричної вакуумної помпи (під контролем
альтиметра) впродовж 1 хв створювали розрідження, еквівалентне 12000 метрам над
рівнем моря. Через деякий час у тварини спостерігалось загальне рухове
збудження, розлад координації рухів і адинамія. Пізніше з'являлись ознаки
порушення ритму дихання, що проявлялось у нерівномірності пауз і виникненні
„великих кусмаулівських” вдихів, що характерно для агонального стану тварини.
Реєстрували час появи другого агонального вдиху або виникнення судом. Після
цього тиск у барокамері поступово нормалізували. Індивідуальні дослідження
стійкості тварин до гіпоксії проводили двічі з інтервалом 3 тижні. У групи ВС і
НС включали лише тих особин, які підтверджували свою належність до групи
високо- або низькостійких до гострої гіпоксії обидва рази. Для виділення
середньостійких тварин використовували формулу: Е = М ± 33 %, де М –
середньоарифметичне часу знаходження „на висоті” всіх тварин. Подальші
дослідження проводились на тваринах не раніше, ніж через 2 тижні з моменту
розподілу на групи.
ГГ викликали введенням натрію нітриту в дозі 30 мг/кг маси тіла тварин (1/6
LD50) під шкіру, один раз на добу, протягом 7 і 14 діб [53, 111]. Біохімічні
дослідження проводили через 1 год після останнього введення NaNO2. Гостру ЦГГ
викликали шляхом крововтрати з стегнової артерії в обсязі 20-25% від загальної
кількості циркулюючої крові [39, 147]; тривалість гіпоксичного впливу становила
30 хв та 1 год – перший та другий терміни. Маніпуляції проводили під наркозом,
викликаним етаміналом натрію (0,1 г/кг у вигляді 1 % розчину
внутрішньоочеревинно).
Експериментальну лікувально-профілактичну корекцію проводили за допомогою таких
препаратів: ліпіну (ХФО „Біолек”, Україна) – по 20 мг/кг внутрішньоочеревинно
[131]; пірацетаму (Галичфарм, Україна) – по 400 мг/кг внутрішньоочеревинно
[164]; селени (А/О Хухтамяки, Новамед-Турку, Фінляндія) – по 40 мкг/кг у шлунок
[131]. Крім ізольованого введення препаратів, застосовували їх комбінації: ЛП,
ЛС, ПС і ЛПС.
Використовували препарати та їх комбінації при ЦГГ за 12 і 2 год до моделювання
гіпоксичного стану. При ГГ препарати та їх комбінації вводили кожні 24 год,
починаючи з 4-ї доби моделювання гіпоксії.
Контролем при ГГ слугували тварини, яким робили підшкірні ін'єкції
дистильованої води (розчинник NaNO2), при ЦГГ – тварини, яким проводили розтин
м’яких тканин стегна без моделювання крововтрати.
Виведення з досліду тварин з ГГ проводили під ефірним наркозом, з ЦГГ – під
етаміналовим наркозом. Для дослідження використовували гомогенати печінки,
мікросоми та мітохондрії гепатоцитів, сироватку крові. Експерименти на тваринах
проводили відповідно до „Загальних етичних принципів експериментів на тваринах”
[47].
Розподіл піддослідних тварин на серії залежно від введення лікувальних агентів
представлений у табл. 2.1.
2.2. Методи дослідження інтенсивності процесів ліпопероксидації
2.2.1. Метод визначення вмісту гідроперекисів ліпідів. Принцип методу
ґрунтується на здатності екстрагованих гептан-ізопропіловою сумішшю ГПЛ
інтенсивно поглинати світло при довжині хвилі л=232 нм [30].
Таблиця 2.1
Розподіл тварин на серії дослідів за різних типів ураження печінки
Умови досліду
Кількість тварин
Гемічна гіпоксія за введення NаNО2
Циркуляторно-гемічна гіпоксія
7 діб
14 діб
30 хв
1 год
Контроль (інтактні)
ВС
12
12
12
12
НС
16
18
16
16
Контроль ураження
ВС
НС
Пірацетам
ВС
НС
Ліпін
ВС
НС
Селена
ВС
НС
ЛП
ВС
НС
ЛС
ВС
НС
ПС
ВС
НС
ЛПС
ВС
НС
До 0,2 мл 10 % гомогенату печінки додавали 4 мл суміші гептан-ізопропанолу
(1:1) і струшували протягом 15 хв. Потім у пробірки додавали по 1 мл розчину
НСІ (рН = 2,0) і 2 мл гептану, інтенсивно струшували і після відстоювання та
розшарування суміші (30 хв) відбирали гептановий шар. Вимірювали його оптичну
густину на спектрофотометрі СФ-16 при довжині хвилі л=232 нм. Як контроль
використовували пробу, яка містила 0,2 мл дистильованої води замість
досліджуваного матеріалу. Розрахунок вмісту ГПЛ проводили за формулою:
С = 10ЧЕЧV1/V2, (2.1)
де Е – оптична густина гептанового шару проби,
V1 – кінцевий об'єм гептанового шару (4 мл),
V2 – об'єм досліджуваного матеріалу (2 мл).
Вміст ГПЛ виражали в умовних одиницях екстинкції (ум. од.) на 1 кг тканини
печінки.
2.2.2. Метод визначення вмісту ТБК-активних продуктів. Принцип методу полягає у
здатності малонового диальдегіду при взаємодії з ТБК у кислому середовищі
утворювати забарвлений комплекс. Дослідження проводили у 10 % гомогенаті
печінки [26].
До 1 мл 10 % гомогенату печінки додавали 1 мл дистильованої води, 2 мл 30 %
розчину трихлороцтової кислоти, 0,2 мл 5 М НСІ, 2 мл ТБК і кип’ятили 15 хв у
водяній бані. Проби охолоджували, осад відділяли центрифугуванням при 3000
об./хв протягом 10 хв. Вимірювали оптичну густину супернатанту на
спектрофотометрі СФ-16 при довжині хвилі л=535 нм проти води як контролю.
Розрахунок проводили, враховуючи коефіцієнт молярної екстинкції для
ТБ
- Киев+380960830922