РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Матеріал дослідження
Таблиця 2.1
Кількісний розподіл матеріалу за стадіями онтогенетичного розвитку Rana temporaria
Стадія розвиткуКількість об'єктів29831832153310361037839104612491250155415Молоді жаби (70 діб)10Зрілі жаби8Усього141 Матеріалом для даного дослідження послужили серця чотирьох об'єктів: земляної жаби, курей, білих безпорідних щурів та людини. Личинок земляної жаби (Rana temporaria) на ранніх стадіях отримували в лабораторних умовах відповідно до рекомендацій, викладених в довідково-методичному посібнику "Объекты биологии развития" [32]. Стадії личинкового розвитку визначали за таблицями ембріонального та личинкового розвитку Rana temporaria [12] (табл. 2.1). Також проводили вимірювання довжини личинок.
Ембріонів курей отримували шляхом інкубації згідно загальноприйнятим методикам [Астауров, 1975]. Визначення стадій ембріонального розвитку проводили, використовуючи відповідні таблиці нормального розвитку ембріона курки за Гамбургером і Гамільтоном (HH) (табл. 2.2).
Статевозрілих безпорідних білих щурів отримували з віварію Дніпропетровської державної медичної академії. Ембріонів експериментальних тварин отримували в лабораторних умовах відповідно до рекомендацій, викладених в довідково-методичному посібнику "Объекты биологии развития" [32].
Таблиця 2.2
Кількісний розподіл матеріалу за строками онтогенетичного розвитку курки
Термін
інкубації, добаСтадія розвиткуКількість
об'єктів2,5 17731983,5218423-2484,5258526-2785,528662996,530873187,5327833-34893581036812381018441221468Новонароджені101тиждень81 місяць82 місяці8Зрілі10Усього183 Стадії пренатального розвитку визначали за відповідними таблицями нормального розвитку (табл. 2.3).
Ембріонів та плодів людини отримували з пологових будинків м. Дніпропетровська. Строк пренатального розвитку визначали шляхом вимірювання тім'яно-куприкового та тім'яно-п'яткового розмірів згідно рекомендацій Л.І.Фаліна [68] (табл. 2.4).
Усього було досліджено 508 об'єктів.
2.2. Методи дослідження
Відповідно до мети і задач дослідження був використаний комплекс методів гістологічного, імуногістохімічного, ультраструктурного, морфометричного, біометричного аналізу, а також комп'ютерне тривимірне моделювання.
Виготовлення серійних гістологічних зрізів 5 мкм та 1 мкм завтовшки, забарвлення мікропрепаратів гематоксилін-еозином, залізним гематоксиліном Гейденгайна, альциановим голубим, за Ван-Гізоном, за Малорі-Слінченко, фарбування зрізів метиленовим синім - азуром II - основним фуксином [41].
Таблиця 2.3
Кількісний розподіл матеріалу за строками онтогенетичного розвитку щурів
Термін
розвитку, добаКількість
об'єктів11101210131014101510168178188218Новонароджені82 тиждень81 місяць82 місяці8Зрілі8Усього122 Мікропрепарати, забарвлені залізним гематоксиліном Гейденгайна, використовували для візуалізації основних клітинних компонентів міокарду, а також з метою гістотопографічного аналізу. Для цього тканину обробляли 2,5% розчином залізо-аміачних квасців протягом 6 хвилин при температурі +60°С та забарвлювали розчином гематоксиліну Гейденгайна (0,5 г гематоксиліну в 10 мл етанолу і 90 мл дистильованої води) протягом 4 хвилин при температурі +70°C. Після обробки забарвлені зрізи заливали в бальзам.
Виготовлення напівтонких зрізів 1 мкм завтовшки (епон-аралдіт; ловікрил), фарбування метиленовим синім - азуром II - основним фуксином [17], світлова мікроскопія проводилися з метою загального гістологічного аналізу, а також для аналізу клітинного складу міокарду раннього серця. Для виготовлення напівтонких зрізів фрагментів серця досліджуваних об'єктів зразки тканини об'ємом 1?1 мм3 відразу після взяття фіксували в охолодженій суміші, яка містила 2 % розчин параформу і 2,5 % глютарового альдегіду на 0,1 М фосфатному буфері (рН 7,3). Матеріал дофіксовували у 1 % розчині чотирьохоксидного осмію на тому ж буфері, зневоджували в охолоджених розчинах спиртів і ацетонів зростаючої концентрації і заливали в суміш епона з аралдітом. На ультрамікротомі отримували зрізи 1 мкм завтовшки, фарбували метиленовим синім - азуром II - основним фуксином [17].
Таблиця 2.4
Кількісний розподіл матеріалу за строками онтогенетичного розвитку людини
Термін розвитку, тижденьКількість об'єктівЕмбріональний період4 105 106 10710810Плодовий період10 612 6Усього62 Для ультраструктурного дослідження використовували метод електронної мікроскопії. Для цього ультратонкі зрізи контрастували водним розчином уранілацетату і цитратом свинцю. Дослідження проводили на електронному мікроскопі ЕМВ-100Б при прискорюючій напрузі 75 кВ і первинних збільшеннях від 2000 до 20000. У цілому, електронно-мікроскопічне дослідження проводили за схемою, запропонованої В.Я.Карупу [17]. Оцінку ультраструктурних особливостей кардіоміоцитів, ендотеліоцитів і міжклітинних структур проводили за оригінальними методиками (деклараційні патенти України № 59109 і № 60079).
Забарвлення гістологічних мікропрепаратів альциановим синім, за Ван-Гізоном, за Малорі-Слінченко проводилося з метою визначення присутності та локалізації сполучнотканинних компонентів міокарду. Фіксування матеріалу проводили в розчині Буена (15 частин пікрінової кислоти, 5 частин нейтрального 10% формаліну, 1 частина 100% оцтової кислоти). Обробку тканини проводили за стандартною методикою для біологічних тканин, після фіксації в зазначеному розчині [41, 67].
Для вивчення процесів формування презумптивного судинного русла міокарду у ембріонів та плодів людини використовували цитоспецифічний маркер ендотелію CD-34, який накопичується в цитоплазмі ендотеліальних клітин, забарвлюючи її в коричневий колір [100]. Для контролю використовувалися ділянки ендокарду, міченого CD-34.
Використання віментину проводилося для маркерування мезенхімн