РОЗДІЛ 2. ОБ’ЄКТИ, МЕТОДИ ПРОВЕДЕННЯ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Об’єкт досліджень
Об’єктом досліджень були рослини соняшника (Helianthus annuus L.) сорту
Піракокс середньопізній, районованого у Львівській області. Соняшник основна
олійна культура України, яку вирощують на 1,5 – 1,7 млн. га. Насіння соняшника
містить приблизно 30% запашної продовольчої олії. Його продукти використовують
в харчовій, хімічній та фармацевтичній промисловостях [7].
2.2. Методика вирощування рослинного матеріалу
Насіння промивали проточною водою, знезаражували 2% KМnO4 протягом 10 хв і
знову промивали дистильованою водою. Після цього насіння заливали водою і
ставили набрякати на 3 години. Набрякле насіння розкладали на вологий
фільтрувальний папір в емальовані кювети. Насіння у термостаті пророщували
протягом 3 діб при температурі +26 о С. Після цього проростки висаджували на
водні розчини хлориду кадмію (1, 10, 100 мкМ) та ацетату свинцю (1,10,1000
мкМ). Контролем слугували рослини, вирощені на дистильованій воді. За 7 діб від
початку досліду рослини пересаджували з розчинів, де був кадмій на розчини:
контроль – на розчини хлориду кадмію 1,10,100 мкМ, 1мкМ CdCl2 – на 10, 100мкМ
CdCl2, 10мкМ – 1, 100мкМ, 100мкМ – 1, 10мкМ, на яких рослини росли ще 7 діб, а
з розчинів з ацетатом свинцю на розчини: контроль – на розчини ацетату свинцю
1,10,1000 мкМ, 1мкМ Pb(CH3COO)2 – на 10, 1000мкМ Pb(CH3COO)2, 10мкМ – 1,
1000мкМ, 1000мкМ – 1, 10мкМ ( Схема 1,2 ). За 7 та 14 діб від початку досліду
визначали індекс толерантності, вміст пероксиду водню, відновленого глутатіону,
активність каталази, пероксидази та глутатіонредуктази.
Схема 1.
Метод пересаджування рослин соняшника на різні концентрації ацетату свинцю
Схема 2.
Метод пересаджування рослин соняшника на різні концентрації хлориду кадмію
2.3. Визначення важких металів у рослинних пробах
Важкі метали у рослинних пробах визначали в розчинах золи на
атомно-абсорбційному спектрофотометрі „С-115 М1” [23]. Для збудження елементів
використовували повітряно-ацетиленове полум’я.
Проби подрібнювали на відрізки 1-3 см та висушували в сушильній шафі при
температурі 60 – 65 °С до повітряно-сухого стану, після чого розтирали в
ступці.
Мінералізацію проводили методом сухого спалювання. Тиглі прокалювали при
температурі 525 °С на протязі 2 годин, охолоджували в ексикаторі і зважували на
вагах 2-го класу точності.
В тигель поміщали пробу та зважували з похибкою ±0,1 г при масі наважки 10 г.
Тигель зважували на вагах 2-го класу точності, після чого поміщали у холодну
пічку і підвищували температуру до 200 – 250°С (до появи диму). Після
припинення виділення диму температуру пічки доводили до 525 °С і проводили
прокалювання на протязі 3 годин. Відсутність частинок, що згоріли, вказує на
повне спалювання. При наявності вуглистих частинок тигель охолоджували і попіл
змочували HNO3. Кислоту випаровували і тигель поміщали знову в пічку і
прокалювали при температурі 525 °С на протязі 1 години. Після закінчення
прокалювання тигель охолоджували і зважували. Після чого знову прокалювали на
протязі 30 хв при температурі 525 °С. Прокалювання та зважування проводили до
досягнення постійної маси тигля з попелом.
Після спалювання попіл змочували бідистилятом та додавали до нього 10-15 мл
азотної кислоти, розведеної (1:1). Накривали тигель і нагрівали на електроплиті
до кипіння. Об’єм тигля фільтрували в мірну колбу об’ємом 50 мл. Тигель та
фільтр декілька раз споліскують гарячим бідистилятом, доводячи об’єм до мітки.
Вміст колби перемішували та залишали для відстоювання на 1 день.
Вміст металів у пробах рослин розраховували по формулі:
Х = ( V ·(A1 – A0) / m) · K,
де Х – масова концентрація визначеного металу в рослинній пробі;
A1 – концентрація металу в розчині попелу, мкг/мл;
A0 – концентрація металу в холостій пробі, мкг/мл;
V – об’єм досліджуваного розчину, мл;
m – маса повітряно-сухої проби речовини, г;
K – коефіцієнт, що враховує зменшення маси наважки рослинної проби.
2.4. Методика визначення індексу толерантності
Індекс толерантності у проростках соняшника визначали за формулою [147]:
2.5. Кількісне визначення вмісту пероксиду водню
Для визначення вмісту пероксиду водню рослинний матеріал гомогенізували та
екстрагували у 50 мМ фосфатному буфері рН 7,0. Гомогенат центрифугували
протягом 15хв при 13 000 g при +5°С. Вміст пероксиду визначали колориметрично
[90]. Для визначення пероксиду до 1 мл супернатанту додавали 3 мл 0,1% Ti(SO)4.
Інтенсивність забарвлення визначали при 410 нм. Калібрувальну криву будували за
Н2О2. Вміст пероксиду водню розраховували у мг на 1 г сирої речовини.
2.6. Кількісне визначення вмісту відновленого глутатіону
Вміст відновленого глутатіону визначали за методом Лея та Касіди [144]. Наважку
рослинного матеріалу гомогенізували у 5% розчині трихлороцтової кислоти у
співвідношенні 1: 4 (наважка/об’єм). Гомогенат центрифугували протягом 15 хв
при 13 000g. У надосадовій рідині спектрофотометрично визначали вміст
відновленого глутатіону, довжина хвилі становила 412 нм. Інкубаційне середовище
містило: 1 мл центрифугату, 2 мл 1,5 мМ реактиву Елмана в калій-фосфатному
буфері (рН 7,0), 1 мл дистильованої води. Контроль: 2 мл 1,5 мМ реактиву Елмана
в калій-фосфатному буфері (рН 7,0), 2 мл дистильованої води. Кількість
відновленого глутатіону (GSH) визначали за калібрувальною кривою і виражали у
мілімоль GSH на 1 г маси сирої речовини.
2.7. Кількісне визначення вмісту загального білка
Визначення концентрації білка проводили спектрофотометрично за поглинанням
[198] за допомогою кумасі синього G-250 в подальшій модифікації: білковий
розчин, який містив від 1 до 20 мкг білка в об’ємі 20 мкл