РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Матеріали дослідження
Похідний 1,4-бенздіазепіну - 14С-феназепам (синтезований у відділі медичної
хімії Фізико-хімічного інституту ім. О.В. Богатського НАН України.)
Реактиви.
1,2-пропіленгліколь чда, Merk (Німечина)
ПЕО-400 чда, Merk (Німечина)
Полівініловий спирт чда, «Sigma» (М=70000 - 100000)
Тритон Х-100 чда, Merk (Німечина)
Твін-80 чда, Merk (Німечина)
Коразол чда
Мурашина кислота чда, Merk (Німечина)
Оцтова кислота чда, Merk (Німечина)
Хлороформ чда
Етанол чда
Гексан чда
Ацетон чда
Прилади.
Сцинтиляційний фотометр - TRІ-CARB 2700 (Canberra PACKARD, США).
ІЧ Фур`є перетворювач - FTІ-8300 Shіmadzu
Спектрофотометр Lambda-9
Фотоколориметр КФК-2
Ваги лабораторні ВЛР-200
Тварини.
Безпородні миші – віварій Одеського медичного університету. До початку
експерименту тварини поміщалися в умовах вільного доступу до їжі та води при
температурі від 18 до 25 оС.
2.2. Методи дослідження
2.2.1. Визначення питомої радіоактивності і радіохроматографічній чистоти
феназепаму
Визначення радіохроматографічної чистоти 2-14С-феназепаму проводили за
допомогою методу ТШХ [5]. Для цього готували розчин з концентрацією 100 мкг
речовини в 1 см3 спирту (0,001%). Визначені об’єми (0,1-1,0 см3) розчинів, що
були отримані, наносили на хроматографічну пластину “Silufol – 254” і
хроматографували, попередньо в CCl4, до нижнього краю пластини, потім в
системі: хлороформ:гексан:ацетон (2:3:1), від старту до верхнього краю
пластини. Нерадіоактивний феназепам був використано нами як «мітчик». Після
хроматографічного поділу пластину розрізали на зони, поміщали в сцинтиляційні
флакони, заливали толуольно - спиртовим сцинтилятором (10 см3) і визначали
вміст радіоактивності в кожній пробі на рідинному сцинтиляційному фотометрі
TRI-CARB 2700 (Canberra PACKARD, США). Питому радіоактивність препарату
(Kи/моль) визначали за формулою:
де ПР – питома радіоактивність (Kи/моль); a – активність зразку, (імп/хв); m –
маса внесеного зразку, (мкг); M - молярна маса феназепаму, (мкг/мкмоль),
2,22·106 – активність 1 мкKи.
Питому активність зразка в Бк розраховували за формулою:
де ПР – питома радіоактивність (Бк/моль); a – активність зразку, (імп/хв); m –
маса внесеного зразку, (мкг); M – молярна маса феназепаму, (мкг/мкмоль).
Радіохроматограма феназепаму містить один пік радіоактивності, що відповідає
фракції, яка містить феназепам. Інші фракції практично не містять радіоактивних
речовин, тому отриманий зразок феназепаму є хроматографично чистим (95,4 ± 2,1
%). Питома активність препарату склала 0,1 Ки /моль (3,7 ГБк/моль).
2.2.2. Визначення порога чутливості до судомних агентів
Судомний агент (коразол) вводили тварині у вигляді 1 % розчину внутрішньовенно
(у хвостову вену) зі швидкістю 0,01 см3/с [138, 139]. Мінімальні ефективні дози
судомного агенту, що викликають клоніко-тонічні судоми (ДКТС) і тонічну
екстензію (ДТЕ), визначали за формулою:
де D – доза коразолу, яка викликає клоніко-тонічні судоми (тонічну екстензію);
V – об’єм розчину коразолу, см3; m – маса тварини, г.
2.2.3. Визначення протисудомної дії феназепаму за тестом «максимального
електрошоку»
Досліджені групи мишей з попередньо введеним феназепамом через визначені
проміжки часу піддавали тесту «максимального електрошоку». Для цього до очних
яблук мишей за допомогою електродів підводився електричний струм (перемінний
струм частотою 50 Гц, силоміць 50 мА, тривалістю 0,2 с). Критерієм
протисудомного ефекту служить попередження тоніко - ектензорного припадку і
смерті тварин [5].
2.2.4. Визначення протитривожної та седативної дії феназепаму за методом
«норкової камери» («відкритого полю»)
Досліджених тварин з попередньо введеним феназепамом через визначені проміжки
часу поміщали у «норкову камеру», що уявляє собою рівномірно освітлену камеру
40 х 40 х 40см, основа якої розділена на 16 рівних квадратів з 16 отворами,
діаметром 1,5 см у центрі кожного квадрату [140]. Спостереження кожної миші
проводили протягом 5 хвилин, щохвилинно реєструючи число уставань на задні лапи
(вертикальні переміщення), число заглядань до отворів (дослідницька активність)
і число перетинання квадратів (горизонтальні переміщення).
2.2.5. Визначення міорелаксантної дії феназепаму за тестом
«обертового стрижня»
Досліджених тварин з попередньо введеним феназепамом через визначені проміжки
часу з моменту аплікації ТТС поміщали на горизонтальний обертовий стрижень
діаметром 2 см і швидкістю обертання 5 об/хв. Спостереження проводили протягом
2-х хвилин. Достовірним вважали прояв міорелаксації, якщо експериментальна
тварина падала зі стрижня не менш двох разів протягом двох хвилин [5].
2.2.6. Вивчення антидепресивної активності феназепаму при різних способах
введення в умовах чорно-білої камери [141]
Досліджених тварин з попередньо введеним феназепамом через визначені проміжки
часу поміщали у «чорно-білу камеру», що уявляє собою ящик, який розділений на 2
відсіка, кожний - 25 х 25 х 25 см. Один із відсіков темний, а другий
освітлювався електричною лампою 40 Вт. Спостереження кожної миші проводили
протягом 5 хвилин з реєстрацією часу находження у світлому відсіку, кількості
виглядань у світлий відсік та переходів між світлим та темним відсіками.
2.2.7. Вивчення антидепресивної активності феназепаму при різних способах
введення в умовах тесту Порсолту [142]
При тестуванні миші, з попередньо введеним феназепамом, опускалися в білий
пластиковий циліндр висотой 40 см та діаметром 30 см, до якого на дві треті
була налита вода (24°С). Тривалість тесту тривала 3 хв. Поведінковим показником
був сумарний час імобільності. Під імобільністю мало
- Киев+380960830922