РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Клітинні лінії та умови їх культивування, лабораторні тварини.
Клітини ліній L1210 та L1210R (резистентні до цисплатину) лімфоцитарної
лейкемії миші, лінії L929 фібробластів миші, лінії А549 карциноми легені
людини, та лінії Jurkat лейкемії людини отримано з колекції клітинних культур
Інституту біології клітини НАН України. Клітини лінії MCF-7 аденокарциноми
молочної залози людини, дикий тип (wt) та резистентні до доксорубіцину (DOX/R)
отримано з колекції Інституту Онкології Польської АН (Глівіце, Польща), клітини
лінії СЕМ гострої лімфобластичної лейкемії людини отримано з колекції клітинних
культур Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім.
Р.Є. Кавецького НАН України.
Клітини ліній L1210, L1210R, MCF-7, A549 вирощували у середовищі Ігла,
модифікованому Дульбекко (DMEM, “Sigma”, США) в присутності декомплементованої
сироватки крові великої рогатої худоби (“Sangva”, Львів) і 50 мкг/мл
гентаміцину (“Sigma”, США). Клітини L929, CEM та Jurkat вирощували в середовищі
RPMI-1640 (Flow Laboratories, Шотландія) в присутності декомплементованої
сироватки крові великої рогатої худоби (“Sangva”, Львів чи “Sigma”, США) і 50
мкг/мл гентаміцину (“Sigma”, США). Клітини пасажували через кожні два-три дні
розведенням клітинної суспензії у відношенні 1:5 – 1:2. Клітини вирощували у
зволоженій атмосфері при 37°C та 5% CO2.
В окремих дослідах клітини лінії L1210 інокулювали гібридним особинам першого
покоління від схрещування ліній DBA2 x Black домашньої миші (Mus musculus).
Після цього клітини розвивались інтраперитонеально упродовж 5–7 днів. Корм та
вода були доступні тваринам ad libitum. Експериментальні тварини утримували
відповідно до вказівок, встановлених Національним Інститутом Здоров’я США [120]
і доступних також на інших мовах [121]. Мишей вбивали шляхом цервікальної
дислокації після попередньої анестезії, клітини виділяли шляхом центрифугування
з асцитної рідини. Мишачі спленоцити отримували із селезінки білих лабораторних
мишей, як описано [122]. Клітини осаджували центрифугуванням та заморожували
при -800С.
Лімфоцити здорових донорів та пацієнтів із автоімунними розладами отримували на
кафедрі імунології Львівського національного медичного університету ім.
Данила Галицького. Лімфоцити виділяли із цільної крові в градієнті
фікол-верографіну чи препарату Lymphoprep (Axis-Shield, Норвегія) відповідно до
вказівок виробника.
Життєздатність клітин перевіряли фарбуванням розчином трипанового синього (0,1%
в/о), кількість клітин підраховували в гемоцитометричній камері.
2.2. Індуктори апоптозу
Для індукції апоптозу використовували хімічні сполуки: цисплатин
(цис-діамінодихлороплатина, Bristol-Myers Squibb Co. США) [123,124],
дексаметазон (дексаметазон-фосфат, ЛьвівДіалік, Україна), метотрексат (Lederle
Parenterars, Carolina, Puerto Rico), доксорубіцин (Ebewe, Австрія), етопозид
(Bristol-Myers Squibb Co. США), та рентгенівське опромінення (300 Рентген, 225
Рентген/хв); біологічні чинники: анти-CD95-антитіла (ІЕПОР, Україна) та
галектин-3 (люб’язно наданий проф. Гансом Ґабіусом, Інститут фізіологічної
хімії, Мюнхен, Німеччина).
Апоптоз мишачих спленоцитів індукували інтраперетонеальною ін`єкцією
дексаметазону, 40 мг/кг маси тварини. Апоптоз в клітин L1210, інокульованих
мишам, індукували доксорубіцином у максимально переносимій дозі 2 мг/кг [125].
2.3. Лектиноцитохімічне дослідження
У дослідженні використовували наступні лектини рослинного та тваринного
походження: LABA, STA, HPL, PHA-E, ConA, PSL, WGA, PMRL, VAA, RCA, NPL, LVA,
GNA, MAA-II. Усі лектини, окрім ConA (Lectinola, Чеська Республіка) та MAA-II
(Vector Lab., США), було виділено та очищено афінною хроматографією в
лабораторії Інституту біології клітини НАН України д.б.н. М.Д. Луциком та
к.ф.н. В.О. Антонюком за відповідними методиками [126]. Лектини було помічено
пероксидазою хрону (HRP), флуоресцеїнізотіоціанатом (FITC) за стандартними
методиками [127]. a-Метил-D-манопіранозид (aMMan) (Sigma Chemical Co, США) та
4-O-(a-D-галактопіранозил)-D-глюкопіраноза (лактоза) (Sigma Chemical Co, США),
маноза та N-ацетил-галактозамін (Sigma Chemical Co, США) використовувались як
специфічні вуглеводні інгібітори відповідних лектинів [128].
Лектин кори золотого дощу Laburnum anagyroides (LABA) – специфічний до залишків
б-L-фукози, ізоформи невідомі, складається з 4-х субодиниць з молекулярною
масою субодиниці 26 кДа, ММ лектину – 100 кДа [129].
Лектин рицини Ricinus communis – у природі виявлений в двох ізоформах. Ізоформа
І (аглютинін, RCA) з ММ 120 кДа і субодиничним складом (27,5)2 (30)+(33),
специфічна до в-D-галактози, використовувалась в даній роботі; ізоформа ІІ
(токсин) має ММ 60 кДа і субодиничний склад (28) + (32), специфічна до D-Gal та
N-ацетил-D-галактозаміну [130].
Лектин омели білої Viscum album I (VAA I) – володіє специфічністю до в-D-Gal,
має ММ 115 кДа і субодиничний склад 2(бв). Лектин не володіє специфічністю до
вуглеводних детермінант груп крові. Він інгібує синтез білків, подібно до
лектину рицини (RCA60), та пригнічує індуковане алергенами вивільнення
гістаміну лейкоцитами людини in vitro [129,131].
Лектин канавалії мечовидної Canavaia ensiformis, чи конканавалін А (ConA),
специфічно зв’язує залишки б-Man, б-Glc та GlcNAc, складається з 4 субодиниць
однакової ММ, загальна ММ лектину 102 кДа. Лектин не є специфічним до груп
крові, для своєї активності потребує іони Ca2+ та Mn2+ [132]. ConA дисоціює на
димери при рН 5,6 чи нижче, в діапазоні рН 5,8-7,0 ConA існує у формі
тетрамеру, при рН > 7,0 утворюються високомолекулярні агрегати лектину [133].
ConA воло
- Киев+380960830922