РОЗДІЛ 2
ВИКЛАД ЗАГАЛЬНОЇ МЕТОДИКИ І ОСНОВНИХ МЕТОДІВ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Гістологічні методи
У даній роботі для дослідження параметрів тимуса хребетних тварин
використовувався комплекс досліджень, які грунтувалися на використанні
гістологічних, гістохімічних та біохімічних методів досліджень.
Більшість гістологічних методів заснована на контрастному забарвленні
цитоплазми і каріоплазми.
Не враховуючи наявність специфічних методів забарвлення (виявлення
гемосидерину, речовини Нісля, імпрегнування нервових волокон, глії та ін.),
гістологічні посібники [736, 737, 738] розподіляють барвники, які
використовуються у гістології, на ядерні і цитоплазматичні.
При використанні ядерних барвників виділяють два основні принципи забарвлення
ядерних структур :
- взаємодія барвників із кислими сполуками у присутності ДНК і РНК, в
результаті чого утворюються солі ;
- використання іонів металів як протрави, поєднання їх з ядерними структурами
(не обовўязково кислими), а потім утворення хелатного комплексу барвника з
іоном металу.
Виявлення ядерних структур за останнім принципом характерно для гематоксилінів,
бразилінів, карміну, алізарину і цілого ряду протравних барвників. Фарбуючою
основою гематоксиліну є гематеїн. Він утворюється в процесі окислення
гематоксиліну (рис.2.1).
HO НО
HO O НО О
CH2 СН2
C OH С ОН
HC О С
CH2 СН2 + Н2О
НО ОН HO O
Рис.2.1 Утворення гематеїну в процесі окисленя гематоксиліну.
Термін окислення або дозрівання гематоксиліну (перехід його в гематеїн) може
тривати від декількох тижнів до декількох місяців, хоч існують методи
прискорення цього процесу. За методом приготування фарбуючих розчинів можна
виділити залізні ( Вейгерта, Гендейгайна) і галунові ( Ерліха, Майера, Маллори)
гематоксиліни, що зумовлено присутністю в них солей заліза або алюмокалієвих
галунів.
При прогресивному забарвленні гематоксиліном розчин підкислюють, це запобігає
перефарбуванню обўєктів. При регресивному забарвленні - надлишкова кількість
барвника ліквідується послідуючим диференціюванням [736]. Речовини, які
забарвлюють цитоплазму клітин, проявляють в основному кислу реакцію. До них
можна віднести еозин, родамін, пікринову кислоту, азокармін, аурамін, кислий
фуксин і ряд інших цитоплазматичних барвників. Значна кількість цих сполук є
карбоновими і сульфоновими кислотами. Вони вступають у реакцію при забарвленні
білків, які мають надлишок діаміномонокарбонових амінокислот. Натрієва сіль
тетрабромфлуоресцеїну або еозин (рис.2.2) забарвлює цитоплазматичні білки у
яскраво-червоний колір. Еозин майже завжди використовують у вигляді 0,5- 1,0 %
розчинів для дофарбування основних білків цитоплазми.
СООNa
Br C Br
+
HO O O
Br Br
Рис.2.2 Натрієва сіль тетрабромфлуоресцеїну (еозин).
2.2. Гістохімічні методи
У представленій роботі топохімічна оцінка процесів у тимусі тварин включає в
себе значну кількість методичних прийомів, які було б доцільно згрупувати у
слідуючих напрямках гістохімічних досліджень :
методи оцінки білково-нуклеїнового обміну ;
методи оцінки метаболізму безазотистих сполук ;
методи оцінки біокаталітичних процесів.
Методи виявлення локалізації нуклеїнових кислот можна згрупувати за способом
дії їх на складові компоненти нуклеотидів з метою отримання відповідної
гістохімічної реакції.
Отримання характерного забарвлення, яке свідчить про присутність
полінуклеотидів, може бути зумовлене впливом на їх компоненти, серед яких слід
виділити :
- гетероциклічні основи, які є похідними пурину або піримідину ;
- пентози, які характерні для відповідних нуклеотидів;
- залишки ортофосфорної кислоти.
Один із методів якісної і кількісної оцінки нуклеїнових кислот, який заснований
на використанні властивостей пуринових або піримідинових основ, може бути
здійснений за допомогою ультрафіолетового опромінення обўєктів при довжині
хвилі 260 нм. Це дослідження характеристик нуклеїнових кислот засноване на
властивості гетероциклічних кілець вбирати ультрафіолетове випромінювання. Не
зважаючи на відсутність прямої дифференціації ДНК і РНК даним методом, він може
використовуватись як метод кількісної оцінки сумарних нуклеїнових кислот
[739].
До групи методів, які направлені на виявлення нуклеїнових кислот завдяки дії на
пентози, слід віднести ряд модифікацій реакції Фьольгена ( з гідразидом
нафтойної кислоти, із світовим зеленим, з азуром А і ін.). Характерною
особливістю даної реакції є те, що в результаті кислотного гідролізу
утворюється альдегідна група, яка дає кольорову реакцію з реактивом Шиффа. Ця
реакція зумовлена відокремленням пуринових основ, звўязаних з С1 - атомом
дезоксирибози. Утворення альдегідів із рибози РНК практично не відбувається, що
дозволяє використовувати специфічність реакції Фьольгена для ідентифікації
ядерного хроматину [740].
Подальше протікання реакцій взаємодії реактива Шиффа з активованою
дезоксиробозою можна уявити як утворення альдегідфуксинового комплексу
(рис.2.3) з пурпуровим забарвленням [741].
H
HO-S-N
H
O C NH2 + 2R C
O O
SO3H
HO-S-N
H
" Лейкофуксин"