РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектом исследования служили эритроциты II(А) группы донорской крови мужчин, заготовленной на консерванте "Глюгицир", со сроком хранения при температуре 2-4 ?С в течение 2-4 дней.
2.1. Получение эритроцитов
Для удаления плазмы и лейкоцитов кровь центрифугировали 10 мин при 1200 g (центрифуга ОПН-3, "Дастан", Кыргызстан). Осадок эритроцитов трижды отмывали четырехкратным объемом среды, содержащей 150 мM NaCl, 10 мM трис-HCl, pH 7.4.
Для экспериментов по оценке ферментативной реакции последняя отмывка была выполнена с использованием среды А (135 мM KCl, 10 мM трис-HCl, 10 мM Hepes (рН 7.4), 0,025 мM MgCl2).
2.2. Определение активности Са2+-АТФазы в эритроцитах
Аликвоты отмытых эритроцитов вносили в среду В (0,04% сапонина, 135 мM KCl, 10 мM трис-HCl, 10 мM Hepes (рН 7.4), 0,025 мM MgCl2, 1 мM АТФ, 1 мM ЭГTA, 1,1 мM CaCl2). При расчете концентрации Са2+ учитывали температурные изменения и наличие в среде Mg2+ и ATФ с использованием программы "MAXChelator" (http://www.standford.edu/~cpatton/maxc.html). Состав среды варьировали, вводя дополнительно разные концентрации глицерина (5 - 60%); или NaCl (150 - 600 мМ); или KCl (150 - 600 мМ). Конечная концентрация клеток в среде соответствовала 10% гематокриту (примерно 106 клеток в 1мкл). Реакцию ферментативного гидролиза АТФ проводили, инкубируя клетки при 37 ?С в течение 20 мин. После этого реакцию останавливали, добавляя холодный раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ) до конечной концентрации 5% [37]. Об изменении активности Са2+-АТФазы под влиянием соответствующих концентраций глицерина, NaCl или KCl судили по разнице накопления неорганического фосфора Pi в Са2+-содержащей и Са2+-несодержащей средах (в этом случае среда В не содержала CaCl2). При оценке Са2+-АТФазной активности в средах, содержащих NaCl, работу Na+-насоса блокировали добавлением оуабаина в конечной концентрации 1 мМ. После остановки реакции белок осаждали центрифугированием при 1000 об/мин.
Удельную активность Са2+-АТФазы эритроцитов рассчитывали на 109 клеток. Подсчет клеток в пробах проводили в камере Горяева.
2.3. Определение неорганического фосфора (Pi)
Определение Pi проводили по методу, описанному в [179]. Из надосадков отбирали аликвоты в количестве 100 мкл и добавляли к 2 мл ацетатного буфера (1,5 М CH3COOH-CH3COONa, pH 4.3), содержащего 3,7% формальдегида и 10% этанола. Далее к каждой пробе последовательно добавляли по 0,1 мл 2%-го раствора молибдата аммония и сразу после него по 0,2 мл 6,75 мM хлорида олова. Пробы колориметрировали при ?=660 нм на спектрофотометре Ломо СФ-46 (Россия). Калибровочный график был линейным до 10 мкг неорганического фосфора в пробе.
2.4. Криоконсервирование и деглицеринизация эритроцитов
К эритромассе добавляли раствор криоконсерванта следующего состава: 30% глицерин, 4% маннитол, 150 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl, pH 7,4, в соотношении 1:1 по объему и инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре (22 ?С) [2], после этого клетки в стальных контейнерах (объемом 10 мл) погружали в жидкий азот (-196 ?С). Для экспериментов по исследованию активности Са2+-АТФазы, в состав криоконсерванта не добавлялся маннитол, поскольку маннитол, поступая в клетку при лизисе ее сапонином, может быть дополнительным (артефактным) модификатором активности фермента. Размораживание проводилось в водяной бане при температуре 42 ?С с постоянным покачиванием. Деконсервированные клетки были разделены на 2 части. Первую часть центрифугировали для осаждения клеток, удаляли надосадок и аликвоты эритромассы переносили в среду В для проведения ферментативной реакции. Параллельно оценивали количество клеток в пробе и уровень гемолиза. Другую часть деконсервированной эритромассы использовали в процедуре деглицеринизации для оценки Са2+-АТФазной активности эритроцитов, возвращенных в нормальные физиологические условия после замораживания-отогрева. Деглицеринизацию эритроцитов выполняли по схеме: 1 этап - осаждение клеток и удаление надосадка; 2 этап - отмывка эритромассы равным объемом 600 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl (pH 7,4); 3 и 4 этапы - отмывка равными объемами среды А [43,207].
После завершения отмывочных процедур аликвоты эритромассы вносили в среду В и определяли активности Са2+-АТФазы эритроцитов как описано выше. Параллельно оценивали количество клеток в пробе и уровень гемолиза.
2.5. Определение уровня гемолиза и гематокрита
Определение уровня гемолиза в надосадочной жидкости проводили спектрофотометрически при длине волны 543 нм и выражали в процентном отношении от общего содержания гемоглобина в пробе [19].
Гематокрит определяли в капиллярах на гематокритной микроцентрифуге МГЦ-8 (Польша).
2.6. Выделение мембран эритроцитов (белые тени) для оценки активности Са2+-АТФазы
Эритроциты лизировали в 30-кратном объеме гипотонической среды (5 мM KCl, 10 мM трис-HCl, pH 7.6) и выдерживали в течение 10-15 мин на ледяной бане. После чего тени осаждали центрифугированием при 20 000 g на рефрижераторной центрифуге (К-24, Германия) с последующим удалением надосадка. Процедуру отмывки мембран от внутриклеточных компонентов повторяли 3-4 раза в аналогичном режиме.
При оценке активности Са2+-АТФазы в белых тенях аликвоты полученных изолированных мембранных фракций добавляли в среду В и отслеживали ферментативную реакцию аналогично условиям, описанным для сапонин-перфорированных эритроцитов.
2.7. Оценка роли кальмодулина в активации Са2+-АТФазы эритроцитов
Для оценки роли кальмодулина в активации Са2+-АТФазы эритроцитов в присутствии 10%-го глицерина в среде применяли ингибитор кальмодулин-зависимых реакций кальмидозолиум R24571 [41] В первой серии экспериментов к клеткам на первом этапе добавляли среду А, содержащую 0,04% сапонин и 20 мкМ R24571. После лизиса клеток вводили глицерин и компоненты реакционной среды (разведенные в среде А) с учетом того, чтобы их конечная концентрация соотв