РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Бактеріальні штами
Об’єктами дослідження були 110 штамів мікроорганізмів, стійких до іонів міді,
кадмію, срібла і ванадію, які було ізольовано з джерел з різним рівнем
техногенного навантаження. Для порівняльних досліджень в роботі були
використані типові та колекційні штами бактерій (табл. 2.1).
Таблиця 2.1
Типові та колекційні штами бактерій, що використовувались в роботі
Бактеріальний штам
Походження
Escherichia coli K12(F)
Колекція відділу молекулярної генетики бактеріофагів, ІМВ НАН України
Escherichia coli J53(RP4)
Колекція відділу молекулярної генетики бактеріофагів, ІМВ НАН України
Pseudomonas aeruginosa УКМ B-1T (ATCC 10145)
Українська Колекція Мікроорганізмів, ІМВ НАН України
Pseudomonas aeruginosa УКМ B-900 (ATCC 9027)
Українська Колекція Мікроорганізмів, ІМВ НАН України
2.2. Поживні середовища та реактиви, використані в роботі
Для культивування та ідентифікації бактерій використовували різні рідкі та
агаризовані поживні середовища (склад середовищ наведено далі по тексту). В
агаризовані середовища додавали 1,5% агар-агару.
Мінеральне середовище М, г/л: КH2PO4 – 0,5; NH4NO3 – 0,5; MgSO4 – 0,1,
дріжджовий екстракт – 0,5; 3-заміщений цитрат Na – 10,0. Середовище
використовували для первинної ізоляції та культивування бактерій.
Середовище Кінг В, г/л: пептон – 20,0; гліцерін – 10,0; K2HPO4 – 1,5; MgSO4 –
1,5; агар-агар – 15,0. Середовище використовували для визначення здатності
бактерій продукувати флюоресцентний пігмент [168].
Середовище Кінг А, г/л: пептон – 20,0; гліцерін – 20,0; K2SO4 – 20,0; MgCl2 –
7,0; агар-агар – 15,0. Середовище використовували для визначення здатності
бактерій продукувати піоцианін [168].
Середовище для визначення аргініндигідролази, г/л: пептон – 1,0; пірідоксин –
0,005; глюкоза – 0,5; бромкрезоловий пурпуровий – 0,01; крезол-рот – 0,005;
l-аргінін – 10,0, МПБ – 5,0. Середовище використовували для визначення
наявності у бактерій аргініндигідролази [169].
Середовище Х'ю-Лейвсона, г/л: пептон – 2,0; K2HPO4 - 0,3; NaCl – 5,0; агар-агар
– 3,0; бромтімолблау – 0,03; глюкоза – 10,0. Середовище використовували для
визначення здатності штамів окислювати та ферментувати глюкозу [170].
Середовище Козера, г/л: MgSO4 - 0,2; NaCl – 5,0; K2HPO4 – 1,0; NH4H2PO4 – 1,0;
агар-агар – 15,0. В середовище додавали 0,1% відповідного джерела вуглецю.
Середовище використовували для визначення здатності бактерій засвоювати різні
джерела вуглецю [72].
Агар Кліглера, г/л: пептон – 20,0; NaCl – 5,0; лактоза – 10,0; декстроза – 1,0;
цитрат амонію заліза – 0,5; Na2SO3 – 0,5; феноловий червоний – 0,025; агар-агар
– 15,0. Середовище використовували для визначення продукування бактеріями
сірководню [171].
Лізуючий буфер для виділення плазмідної ДНК: сахароза – 10%; NaOH – 100 мM; KCl
– 60 мM; EДTA – 5 мM; SDS – 0,25%; бромфеноловий синій – 0,05% [172].
Хімічні реактиви. В роботі використовувались хімічні реактиви виробництва фірми
„SIGMA” (США) і реактиви вітчизняного виробництва кваліфікації „осч” та „хч”.
2.3. Методи досліджень
В роботі використовували мікробіологічні, фізіологічні, фізико-хімічні та
молекулярно-генетичні методи.
2.3.1. Відбір зразків та ізоляція мікроорганізмів, стійких до іонів важких
металів
Зразки грунту, води та повітря відбірали з джерел з різним рівнем техногенного
навантаження, перелік яких наведений в табл. 2.2. Зразки були відбрані навесні
та влітку 2003 року. Зразки зберігали в стерильних пакетах або колбах при 40С.
Ізоляцію стійких до іонів металів мікроорганізмів проводили наступним чином: 5
г кожного зразку додавали до 45 мл рідкого середовища М та струшували протягом
10 хв. Якщо зразок був у вигляді рідини, то 5 мл зразку додавали до 45 мл
середовища М та обробляли як вказано вище. pH середовища доводили до 7,0-7,2.
Іони металів вносили окремо після їх стерилізації в таких концентраціях: Cu2+ -
1,0 г/л у вигляді CuSO4x5H2O, V5+ - 1,0 г/л у вигляді NH4VO3. Приймаючи до
уваги високу токсичність Cd і Ag, їх вносили в менших концентраціях – 0,5 г/л
Cd2+ (у вигляді Cd(NO3)2) і 0,1 г/л Ag+ (у вигляді AgNO3). Зразки інкубували
протягом 72 год. при 300С. В подальшому відповідні розведення накопичувальних
культур висівали на агаризоване середовище М, з додаванням іонів кадмію, міді,
срібла чи ванадію в концентраціях, вказаних вище. Чашки інкубували в термостаті
при 300С протягом 3 діб при ізоляції штамів, стійких до іонів міді, кадмію і
ванадію, або протягом тижня при виділенні штамів, стійких до іонів срібла.
Таблиця 2.2
Джерела виділення стійких до іонів металів мікроорганізмів
Джерело виділення
з низьким рівнем техногенного навантаження
з високим рівнем техногенного навантаження
Лісовий грунт, Яготинський р-н, Київська обл.
Грунт біля автозаправної станції, м. Київ
Орний грунт, Яготинський р-н, Київська обл.
Грунт з території заводу комунального машинобудування “Коммаш”, м.Київ
Коров'ячий гній, приватне господарство, с. Новосілки, Київська обл.
Дренажні води муніципальних сміттєзвалищ, с. Пирогів, м. Київ
Курячий послід, приватне господарство, с. Новосілки, Київська обл.
Стічні води з території заводу комунального машинобудування “Коммаш”, м. Київ
Кар'єрний пісок, Яготинський р-н, Київська обл.
Повітря лабораторії відділу фізіології промислових мікроорганізмів, Інститут
мікробіології і вірусології, м. Київ
При ізоляції стійких до іонів металів мікроорганізмів з повітря лабораторії
чашки з агаризованим середовищем М, що містило відповідні концентрації іонів
міді, кадмію, ванадію чи срібла, залишали відкритими на 15-30 хв. та у
подальшому інкубували в термостаті при 300С, як описано вище. Чашки, колби і
пробірки з середовищем, що містили іони срібла, загортали в папір, що не
пропускав світл
- Киев+380960830922