РОЗДІЛ 2
МЕТОДИКА ДОСЛІДЖЕНЬ.
2.1. Виділення ізольованих гладеньком’язових клітин.
Для дослідів використовувались короткошерсті тварини обох статей вагою 250 –
350 г. Кишечник морської свинки (рис. 2.1) має наступні частини: тонкий
кишечник довжиною близько 130 см, сліпа кишка (10 см), товстий кишечник (60 см)
та пряма кишка (3 см).
Гладеньком’язова тканина характеризується щільною упаковкою її клітин і добре
розвинутим сполучним матриксом,
Рис 2.1. Анатомічна будова морської свинки. Підписи подано на рисунку.
що об’єднує ці клітини. Бегбі [166] один з перших розробив спосіб виділення
поодиноких ізольованих гладеньком’язових клітин із стінок шлунка Bufo marinus.
Цей метод включав обробку тканин при температурі 31 0С протягом 2,5 – 3 годин
протеолітичними ферментами (трипсин, колагеназа) і наступною механічною
ізоляцією клітин. Пізніше такий спосіб був модифікований і адаптований для
гладеньких м’язів ссавців. Цей метод дозволяє отримувати поодинокі клітини,
вільні від сполучної тканини, що дуже важливо в умовах отримання гігаомного
контакту між реєструючою піпеткою та мембраною клітини.
Досліди проводились на свіжоізольованих поодиноких гладеньком’язових клітинах,
які виділяли із тканини taenia caeci (поздовжнього стрічкового м’язу сліпої
кишки морської свинки, рис 2.2) шляхом ферментативно-механічної ізоляції.
Гладеньком’язові смужки taenia caeci вирізались та очищувались від сполучної та
жирової тканини в теплому фізіологічному розчині (розчин А, табл. 2.1). Для
виділення поодиноких ГМК ізольовані м’язові смужки переносили в номінально
безкальцієвий розчин (розчин Б) приблизно на 10 хв при температурі 34єС. Надалі
смужки нарізались на окремі шматочки довжиною 2 – 3 мм та вміщувались в 2 мл
підігрітого свіжого безкальцієвого розчину, що містить: 3мг колагенази (тип
ІА), 2 мг бичачого сироваткового альбуміну, 2 мг соєвого інгібітору трипсину та
2 мг таурина. Соєвий інгібітор необхідний для виключення впливу на клітинну
мембрану неспецифічних протеаз, що у вигляді домішок знаходяться в препаратах
колагенази. Таурин використовувався як антиоксидант (поглинач вільних
радикалів) для стабілізації мембрани та зменшення впливу вільних радикалів на
мембранні білки.
Рис 2.2. Анатомія сліпої кишки морської свинки
В цьому розчині шматочки тканини інкубувались 25 – 35 хв при температурі 34єС.
Надалі тканина відмивалась від ферментів протягом декількох хвилин в розчині Б
при кімнатній температурі. Функціонально повноцінні ізольовані ГМК отримували
шляхом обережного, багаторазового пропускання шматочків тканини через
пастерівські піпетки різного діаметру в безкальцієвому розчині з додаванням
0.1% бичачого сироваткового альбуміну. Помутніння розчину свідчило про
утворення суспензії ізольованих клітин. Суспензію зберігали при температурі 4°С
у розчині з низьким вмістом іонів кальцію (0.25 мМ), щоб запобігти розвитку
кальцієвого шоку.
Ізольовані ГМК taenia caeci мали середній розмір 100 ґ 5 мкм, великий вхідний
опір (1-3 ГОм), зберігали всі компоненти іонних провідностей, а також
скорочувались у відповідь на прикладення гіперкалієвого розчину. Наведені факти
свідчать про збереження функціональності мембрани та скоротливого апарату
ізольованих ГМК.
2.2. Електричні виміри
Для вивчення трансмембранного іонного струму ізольованих ГМК в роботі було
використано метод фіксації потенціалу (“patch-clamp”) [167]. Основа цього
методу полягає у створенні між мембраною та відносно великим кінчиком піпетки
високоомного (1 ГОм та більше) контакту з подальшим руйнуванням ділянки
мембрани під піпеткою для забезпечення доступу до внутрішнього середовища ГМК.
Наразі перевага в таких дослідах віддається свіжоізольованим клітинам, оскільки
в культурі з ГМК відбуваються морфологічні та структурно-функціональні зміни.
Для проведення досліджень суспензії клітин наносили на скляне дно
експериментальної камери об’ємом 500 мл, закріпленої на предметному столі
інвертованого мікроскопа. Через декілька хвилин починали перфузію камери
зовнішнім розчином, за таких умов в камері залишались лише прикріплені до скла
клітини. Для дослідження вибирались розслаблені видовжені клітини з гладенькою
мембраною. Фіксація потенціалу, виміри та підсилення іонних струмів відбувалось
за допомогою підсилювача “L/M EPC-5”, з опором зворотнього зв’язку
перетворювача струм-напруга 10 ГОм. Сигнал з виходу перетворювача струм-напруга
надходив через фільтр низьких частот (частота зрізу 1 кГц) на
аналогово-цифровий перетворювач і далі на комп’ютер IBM PC/AT.
Дані аналізувались за допомогою програм “pCLAMP 5.5”, “Origin6.1”. Блок – схема
експериментальної установки наведена на рисунку 2.3.
Рис 2.3 Схема експериментальної установки та системи перфузії.
1 – експериментальна камера
2 – мікроелектрод відведення
3 – індиферентний електрод
4 – експериментальні розчини
5 – крани
А1 – перетворювач струм-напруга
АЦП – аналогово-цифровий перетворювач
ЦАП – цифрово-аналоговий перетворювач
ЕОМ – комп’ютер
2.2.1. Скляні мікропіпетки відведення. Скляні мікропіпетки для вимірювання
інтегрального іонного струму виготовлялись з м’якого молібденового скла за
методом, описаним Хаміллом та ін. [167]. Витягування піпеток відбувалось в одну
стадію за допомогою модифікованого апарату МЕ-4. На заключній стадії проводили
процедуру теплового полірування кінчиків мікропіпеток. Після оплавлювання
кінчиків та заповнення мікропіпеток розчинами Е або Ж (табл. 2.2) опір
мікропіпеток становив 2 – 4 МОм.
2.2.2. Дослідження інтегральних трансмембранних іонних струмів. Для вимірювання
інтегрального іонного струму цілої клітини використовувався метод фіксації
потенціалу в режимі вну
- Киев+380960830922