Розділ 2 МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Групи піддослідних тварин.
Об'єктом дослідження стали серця від 212 статевозрілих безпородних щурів-самиць, яким у віці 3-4 місяці хірургічно моделювали стан гіпотиреозу. Вивчали чотири групи тварин, кількісні дані про які представлені в таблиці 2.1.
I група - віварійний контроль (не оперовані щури);
II група - тварини, яким хірургічно моделювали стан гіпотиреозу;
III група - тиреоїдектомовані щури які отримували гормонзамісну терапію L-тироксином (виробник - "Фармак", Україна) у дозі 10мкг/кг маси тварини per os;
IV група - прооперовані тварини, які отримували комбіноване лікування L-тироксином (виробник - "Фармак", Україна) у дозі 10мкг/кг маси тварини per os та кальцитоніном (препарат "міакальцик", виробник - "Novartis", Швейцарія) у дозі 1,0 МО/кг маси внутрішньом'язово;
V група - щури, яким після видалення щитоподібної залози була проведена трансплантація фетальної щитоподібної залози.
Утримання, догляд за тваринами, маркування і всі маніпуляції проводили відповідно до положень "Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та наукових цілей" (Страсбург, 1985). Комісією з біоетики Національного медичного університету імені О. О. Богомольця встановлена відповідність проведених наукових досліджень етичним вимогами згідно наказу МОЗ України №231 від 01.11.2000 року.
Табл.2.1 Розподіл тварин за характером проведених досліджень
Групи щурівДоби після операціїФізіологічні методи Біохімічне дослідження кровіБіохімічне дослідження міокардаГістологічні дослідженняI група
(15 щурів)-510103II група
(70 щурів)145-1043551211550511115100514105III група
(64 щура)145-853559855051195100516145IV група
(58 щурів)14---535-12-450-12-5100---5V група
(5 щурів)100-5-5
2.2. Моделювання гіпотиреозу.
Гіпотиреоз моделювали хірургічно розробленим методом (Патент №27821, Україна, МПК G09B23/28(2006.01) Спосіб моделювання гіпотиреозу у щурів// Стеченко Л.О., Петренко В.А., Бик П.Л., Кузян В.Р., Куфтирева Т.П.; Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця-№u200708689; Заявл. 30.07.2007.).
Операцію проводили наступним чином:
Попередньо проводили премедикацію тварин: атропін 0,25мг/кг, димедрол 0,5 мг/кг - внутрішньом'язово.
Знеболювали: кетаміну гідрохлоридом 70-100мг/кг - внутрішньо-м'язово.
Операцію починали з поздовжнього розрізу на шиї, довжиною до 3 см по серединній лінії. Тупим способом розсували фасції шиї, по серединній лінії розсували грудинно - під'язикові м'язи. Накладали два вузлових шкірно-м'язових шва-тримачі, за які розводили цапками краї операційної рани. Під капсулу щитовидної залози вводили 0,2 мл 0,5 % р-ну новокаїну інсуліновим шприцом. По серединній лінії термокоагулятором перепалювали перешийок залози, коагулювали краніальні та каудальні судини обох часток залози. Двома очними анатомічними пінцетами, починаючи від відповідної частини перешийка, відокремлювали кожну частку щитовидної залози в каудо-краніальному напрямку, відділяючи поворотній нерв та прищитоподібні залози від паренхіми щитовидної залози. Контролювали гемостаз. Восьмиподібним швом зводили розведені м'язи, поверхню яких зрошували розчином біциліну-5 для профілактики гнійних ускладнень. Накладали вузлові шви на шкіру. Таким чином, на відміну від існуючих способів [79], забезпечувалась збереженість поворотнього нерва та прищитоподібних залоз.
2.3. Фізіологічні методи дослідження.
Біоелектричну активність міокарда піддослідних щурів вивчали за електрокардіограмами у II стандартному відведенні з реєстрацією кривих на Мінгографі-34 ("Siemens-Elema", Швеція). Всіх тварин наркотизували шляхом внутрішньочеревного введення етаміналу натрію у дозі 40 мг/кг.
Проникність еритроцитарних мембран вивчали за допомогою показника мембранних процесів - осмотичної резистентності еритроцитів (ОРЕ), який відноситься до основних показників, що використовуються для оцінки функціонального стану клітин і є інформативним тестом для виявлення навіть незначних початкових порушень в організмі. Зміни ОРЕ часто випереджають порушення інших показників і часто розглядаються ранніми маркерами патологічного стану.
ОРЕ визначали за методом Дейсі, принцип якого полягає у зміні ступеню гемолізу еритроцитів (у відсотках) в серії забуферених гіпотонічних розчинів натрію хлориду (у розведеннях від 0,5% до 0,1%, рН 7,4) [34].
У 0,5% - 0,45%-них розчинах завжди зазнають лізису найменш стійкі клітини, які характеризуються мінімальною резистентністю. У 0,35% - 0,1% розчинах руйнуються найбільш стійкі. Підвищення ОРЕ свідчить про зрушення межі у бік низьких концентрацій NaCl, зниження - в бік високих. Чим вища ступінь гемолізу, тим нижча резистентність і вища проникність мембран. Найбільш показово про ті чи інші зміни ОРЕ свідчать дані, отримані в 0,4% розчині натрія хлориду.
2.4. Біохімічні методи дослідження.
Для контролю ефективності гіпотиреозу, у дослідних тварин досліджували вміст тироксину в сироватці крові імуноферментним методом. Вміст рівня іонізованого та загального кальцію в сироватці крові визначали титруванням. Дослідження проводились в умовах клінічної лабораторії.
Процеси пероксидного окислення ліпідів оцінювали за рівнем вторинних продуктів ліпопероксидації у гомогенатах міокарда, які визначали спектрофотометричним методом при спонтанній неіндукованій ліпопероксидації за накопиченням в інкубаційному середовищі тіобарбітурат -позитивних продуктів, основним представником яких є малоновий діальдегід - маркер оксидативного стресу. Крім того, в гомогенатах міокарда визначали активність індукованого ферментативно-залежного ліпопереокислення при використанні у ролі прооксиданта системи НАДФН+ та сульфату заліза (ІІ).
Вивчення жирнокислотного складу ліпідів міокарду у експериментальних щурів проведено методом газ