РАЗДЕЛ 2.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Объект и условия эксперимента
В работе использовали 3-х месячных белых беспородных крыс-самок (n=210).
Моделирование ХОА выполняли в соответствии с моделью, которая включает в себя
три этапа. Первый этап – отбор животных склонных к алкоголизации. Он
производился на основании отборочного теста: за 1 сутки до проведения теста
животные лишались пищи и доступа к воде; животные, помещенные в индивидуальные
клетки, получали по 1 мл 40% раствора этанола на кусочках белого хлеба;
критерием отбора являлось количество съеденного хлеба в течение часа –
животные, съедавшие менее половины кусочка, выбраковывались. Второй этап –
привыкание животных к алкоголю. Длительность второго этапа составляла две
недели. В первую неделю крысы находились на обычной диете, но вместо воды в
поилках получали 5% раствор этанола, во вторую неделю 5% раствор этанола
заменялся 15% раствором. Третий этап – интенсивная алкоголизация. Вместо
обычной диеты животные получали 96% раствор этанола на кусочках белого хлеба и
15% раствор этанола как единственный источник жидкости. Суточная доза алкоголя
составляла 14-18 г/кг массы тела в сутки. Два раза в неделю крысы получали
побеги овса. Длительность третьего этапа составляла одиннадцать недель. После
завершения последнего этапа животных переводили на малую дозу алкоголя (15% -й
раствор – как единственный источник жидкости).
Животные содержались в стандартных условиях вивария ИПКиК НАН Украины.
Эксперименты проводили по регламенту, утвержденному биоэтическим комитетом
ИПКиК НАН Украины, который разработан в соответствии с «Общими принципами
экспериментов на животных», одобренными I Национальным конгрессом по биоэтике
(Киев, Украина, 2001) и согласованным с положениями «Европейской конвенции о
защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других
научных целей» (Страсбург, Франция, 1986).
Криоконсервированные клетки фетальной печени и мозга человека, а также цитозоль
фетальных тканей получали в низкотемпературном банке ИПКиК НАН Украины.
Концентрация криоконсервированных клеток составляла около 30 млн/мл,
концентрация общего белка в криоконсервированном цитозоле фетальных тканей
составляла около 1 мг/мл. Образцы размораживали на водяной бане при 37°С
непосредственно перед введением. Схема формирования экспериментальных групп
представлена в таблице 2.1.
Таблица 2.1
Формирование экспериментальных групп
Группа
Алкоголизация
Характеристика экспериментального воздействия
Дозировка
Способ введения
Кратность введения
Интактная
(n=10)
Контроль (ХОА)
(n=10)
Интенсивная
Группа сравнения (КЗС)
(n=10)
В малых дозах
0,3 мл КЗС/100 г массы тела
В бедренную вену
Однократно
КФП
(n=10)
В малых дозах
107 КФП/0,3мл КЗС на 100 г массы тела
В бедренную вену
Однократно
КФМ
(n=10)
В малых дозах
107 КФМ/0,3мл КЗС на 100 г массы тела
В бедренную вену
Однократно
КФМ+КФП
(n=10)
В малых дозах
57 КФП/0,15 мл КЗС + 57 КЭМ/0,15 мл КЗС на 100 г массы тела
В бедренную вену
Однократно
ЦФТ
(n=10)
В малых дозах
0,3 мл ЦФТ/100 г массы тела
В бедренную вену
Однократно
Исследование сроков переживания и характера распределения КФП и КФМ в организме
животных выполняли через 14 дней после внутривенного введения здоровым
животным, а также через 14 и 28 дней после введения крысам с ХОА.
Исследование биохимических показателей в плазме крови, мониторинг общего
состояния организма выполняли после окончания интенсивной алкоголизации, через
7, 14 и 28 суток после внутривенного введения криоконсервированных фетальных
клеток печени и головного мозга, а также цитозоля фетальных тканей или КЗС;
контроль прооксидантно-антиоксидантного баланса и патоморфологическое
исследование печени и головного мозга осуществляли после окончания интенсивной
алкоголизации, через 14 и 28 суток после внутривенного введения фетальных
клеток, цитозоля фетальных тканей или КЗС.
2.2. Подготовка биологического материала для исследований
Биохимические показатели определялись в сыворотке крови, гомогенатах печени и
головного мозга. Кровь собирали из хвостовой вены в пробирки, охлаждали при 0 -
4 єС в течение 20 мин и центрифугировали 20 мин при 3000 об/мин. Полученную
сыворотку хранили на льду до изучения показателей.
Гомогенаты печени и головного мозга готовили следующим образом. Сразу после
декапитации животных производился забор материала для морфологического
исследования, после чего печень перфузировали in situ охлажденным
физиологическим раствором. Печень и головной мозг, извлекали и помещали в
охлажденную среду, готовили 25%-ный гомогенат на 50mM tris-HCl буфере,
содержащем 50mM NaCl (рН 7,4). Гомогенат хранили на льду до изучения
показателей.
2.3. Методы исследования
2.3.1. Методы оценки общего состояния организма
В качестве методов оценки общего состояния организма подопытных крыс
учитывались состояния шерстного покрова, масса тела, смертность,
детоксикационная функция организма.
Для оценки состояния шерстного покрова применялась разработанная нами
пятиуровневая шкала:
первый уровень – блестящий, лоснящийся шерстный покров, волосы не выпадают, не
ломаются;
второй уровень – шерстный покров тусклый, без выпадения и ломкости волос;
третий уровень – шерстный покров тусклый, волосы ломкие, выпадение волос
умеренно выраженное;
четвертый уровень – шерстный покров тусклый, волосы ломкие, отмечается
выраженное выпадение волос;
пятый уровень – шерстный покров тусклый, волосы ломкие, наблюдается выраженное
выпадение волос, присутствует гнездная алопеция (одиночные или множественные
очаги)
- Киев+380960830922