ГЛАВА 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Матеріали досліджень
Метил-біс-(?-хлоретил)-аміна гідрохлорид, який використовується як протипухлинний засіб алкілуючої дії і відомий під назвою ембіхін (Antimit, Azotmustarda, Caryolysin, Chlormetine, Mustargen), синтезовано у відділі синтезу та аналізу лікарських засобів Інституту фармакології та токсикології ( серія 50295 ).
В якості антиоксидантів використовували ?-токоферолу ацетат (ацетат-2,5,7,8-тетраметил-2-(4?,8?,12?-триметилтридецил)-6-оксихроман) у вигляду субстанції, та ацетат-2,5,7,8-тетраметил-2-(4?-метилпентен-3?-ил)-6-оксихроман (Евіт). Обидві сполуки синтезовано АТ "Київський вітамінний завод".
Дослідження проведено на білих щурах (180 - 220 г) та білих мишах (18 - 22 г) обох статей. Тварини утримувались в умовах віварію розплідника Інституту фармакології та токсикології АМН України за сталої температури повітря (20?20С) та вологості (відносна вологість 50?5%), з світловим періодом 12 год (з 7 до 19 год). Харчування здійснювали стандартним раціоном за умов вільного доступу до водогінної води. З метою зменшення стресових ситуацій тварин привчали до рук експериментатора, всі маніпуляції здійснювали без використання інструментарію.
Водний розчин ембіхіну готували ex tempore, вводили одноразово внутрішньовенно у дозі 0,4 мг/кг маси тіла щурів в бічну хвостову вену. Вибір дози ембіхіну грунтувався на експериментальних дослідженнях дозозалежної генотоксичної дії алкілуючого агенту на соматичні клітини тварин. Оскільки доза ембіхіну 0,4 мг/кг (1/4 ЛД50) проявила максимальну генотоксичну дію за показниками хромосомних аберацій, а більш висока доза викликала значне зниження мітотичної активності клітин кісткового мозку, в подальших дослідженнях було використано саме дозу 0,4 мг/кг.
Олійні розчини вітаміну Е та Евіту вводили внутрішньошлунково за допомогою металевого зонду в ЕД50 детоксикуючої дії стосовно ксенобіотиків-прооксидантів, що складає відповідно 15 і 10 мг/кг маси тіла [179]. Шлях уведення було обрано, виходячи з даних літератури, які стверджують, що гідроліз ефірів ?-токоферолу відбувається у кишковому тракті за участі панкреатичної естерази жовчі з подальшою абсорбцією слизовою кишечника вільного ?-токоферолу [280].
2.2. Методи дослідження мутагенності
Для вивчення дозозалежних ефектів генотоксичної дії ембіхіну на соматичні клітини тварин було розподілено на 4 групи, не менше, ніж по 6 щурів у кожній: перша - інтактні тварини, щурам другої - четвертої груп вводили ембіхін у дозах 0,16 мг/кг (1/10 ЛД50), 0,4 мг/кг ( 1/4 ЛД50 ), 0,8 мг/кг (1/2 ЛД50) відповідно.
З метою зупинки поділу клітин на стадії метафази за 2 год до знеживлення тваринам внутрішньочеревинно вводили колхіцин фірми Roussel Uclaf (марка IVO139 BA, Франція) у фізіологічному розчині у дозі 2,5 мг/кг маси тіла.
Знеживлювали тварин методом цервікальної дислокації хребців через 20 год після введення ембіхіну, що відповідає періоду першого мітотичного поділу клітин кісткового мозку.
Дослідження генотоксичної дії алкілуючого агенту на соматичні клітини тварин та коригуючого впливу похідних вітаміну Е проводили метафазним за методом С. Е. Ford та J. H. Hamerton ?226?. В основі методу лежить реєстрація структурних пошкоджень хромосом (хромосомних аберацій) та кількості геномних змін в клітинах кісткового мозку на стадії метафази.
У тварин видаляли стегнову кістку, зрізали епіфізи та з допомогою гіпотонічного (0,55 %) розчину хлориду калію вимивали кістковий мозок, піддавали гомогенізації та подальшій фіксації у розчині, який містить етанол та льодяну оцтову кислоту у співвідношенні 3 : 1. Препарати метафазних хромосом готували на вологих холодних предметних скельцях, фарбували за Унна-блю ?226?.
Хромосомні та геномні порушення в клітинах кісткового мозку тварин вивчали відповідно до вимог метафазного аналізу ?30?, використовуючи схему стандартного каріотипу лабораторного щура, затверджену Міжнародним комітетом по стандартизації каріотипу щурів ?210?. Після попереднього огляду препаратів під малим збільшенням мікроскопа аналізували 50-100 метафаз від кожної тварини, використовуючи імерсійну систему мікроскопа МБІ-6.
Показником цитогенетичного ефекту в клітинах кісткового мозку щурів були структурні хромосомні аберації (одиночні та парні фрагменти, делеції, пульверизації), геномні зміни (анеуплоідія) та зміна плоїдності клітин (поліплоїдія) ?30, 226?.
В окрему групу порушень генетичного апарату клітин виносили наявність щілин у структурі хромосом. Ця патологія розглядається деякими дослідниками як результат токсичної дії ксенобіотиків і вважається "хромосомною передпатологією" ?5, 210, 221?.
2.3. Методи вивчення гонадотоксичності
Гонадотоксичну дію алкілуючої сполуки та гонадопротекторну ефективність профілактичного введення вітаміну Е та Евіту протягом 30 днів досліджували на чотирьох групах щурів-самців. Першою групою були інтакні тварини, щурам другої групи вводили ембіхін у дозі 0,4 мг/кг (негативний контроль), третій та четвертій профілактично вводили вітамін Е та Евіт в дозах 15 та 10 мг/кг маси тіла, відповідно, та ембіхін у дозі 0,4 мг/кг на 30-у добу.
Через 24 год після введення алкілуючої сполуки тварин знеживлювали, виділяли обидва сім'яники, визначали їх об'єм та масу. Один сім'яник фіксували у 10%-ному формаліні для гістологічних та морфометричних досліджень стану сперматогенного епітелію, а з іншого готували гомогенат, який використовували для біохімічних досліджень.
Морфометричні дослідження проводили з допомогою мікроскопа МБІ-6 на гістологічних препаратах товщиною 5 мкм, пофарбованих традиційним методом (гематоксиліном та еозином). Визначення індексу сперматогенезу проводилось за 4-бальною системою, яка передбачає наявність 4-х шарів сперматогенного епітелію. Реєстрували дегенеративні зміни в зрізах канальців (злущення сперматогенного епітелію, відшарування його від базальної мембрани, наявність "вікон" у шарі