РАЗДЕЛ 2.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКИ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1 Методические подходы
Для исследования синаптической передачи в гиппокампе крыс использовались
следующие методические подходы:
а) приготовление срезов гиппокампа крыс;
б) регистрация антидромно- и ортодромно- вызванных потенциалов действия в ответ
на электрическую стимуляцию среза;
в) регистрация возбуждающих постсинаптических токов в ответ на электрическую
стимуляцию среза методом “петч-кламп” в конфигурации “целая клетка” при
одновременной фиксации потенциала;
г) препарирование срезов с помощью водоструйного ножа для визуализации
пирамидных нейронов СА1 поля гиппокампа и получения доступа к сомам нейронов.
2.2 Экспериментальные животные
В экспериментах использовались белые крысы линии Вистар WAG\GSto (Москва,
Россия) возрастом 18-30 дней, которые поддерживались на стандартной
лабораторной диете в виварии Института физиологии им. А. А. Богомольца НАН
Украины. Выбор животных молодого возраста объясняется относительной легкостью
получения гигаомных контактов между пипеткой и мембраной нейронов таких
животных, а также меньшей степенью разветвленности дендритного дерева, что
улучшает качество фиксации потенциала.
Кроме того, мозг молодых животных лучше выдерживает условия приготовления
препаратов срезов мозга и позволяет свести к минимуму влияние травмы на
дальнейшую регистрацию синаптической активности.
2.3 Електрофизиологические измерения
2.3.1 Приготовление срезов гиппокампа
После декапитации животного обе половинки гиппокампа быстро переносили в чашку
Петри, содержащую охлажденный (+5оС) раствор следующего состава (в милимолях):
NaCl 125; NaHCO3 26; KCl 5; MgCl2 3; глюкоза 20. Раствор постоянно насыщался
газовой смесью О2 (95%) и CO2 (5%), рН раствора при этом поддерживался на
уровне 7,35-7,4. Для предотвращения травматического повреждения вследствие
гиперактивации НMDA-рецепторов использовали раствор, несодержащий ионов Са2+.
После охлаждения гиппокамп переносили на покрытый фильтровальной бумагой
плексигласовый столик с отверстиями, герметически соединенными с насосом.
Создаваемое насосом отрицательное давление обеспечивает прочную фиксацию срезов
на подложке.
Срезы толщиной 300-600 мкм нарезали с использованием тонкого лезвия при
постоянном увлажнении поверхности гиппокампа (Рис. 2.1).
После нарезания и разделения срезы переносили в инкубационную камеру, где они
находились в течение 30-40 минут при температуре +31оС, а затем еще 60 минут
при комнатной температуре перед экспериментом (Рис. 2.2). Это время было
необходимо для устранения последствий травмы, возникшей при препарировании.
При условии, что время от момента декапитации до помещения срезов в
инкубационную камеру не превышало 10 минут, описанная процедура позволяла
получать жизнеспособные срезы, которые генерировали потенциалы действия в ответ
на электрическую стимуляцию в течение 8-10 часов.
Регистрацию электрофизиологических параметров проводили при температуре +31оС
или при комнатной температуре в экстраклеточном растворе следующего состава (в
мМ): NaCl 135; NaHCO3 18; KCl 2,7; СаСl2 1,5; MgCl2 1,5; глюкоза 20 (pH
7,35-7,4 при насыщении газовой смесью О2 и CO2). Тормозные влияния,
опосредованные активацией ГАМКА- рецепторов устраняли, добавляя во внеклеточный
раствор антагонисты этих рецепторов бикукулин или пикротоксин в концентрации
25-50 мкМ.
2.3.2 Регистрация вызванных популяционных потенциалов
Для получения вызванных синаптических ответов в поле СА1 гиппокампа
использовалась биполярная стимуляция коллатералей Шаффера с помощью двойных,
изолированных по всей длине, кроме кончиков, нихромовых электродов толщиной 50
мкм. Стимуляция импульсами тока 0,1-1 мА или напряжением 3-30 мВ
продолжительностью 50-250 мкс обеспечивалось с помощью гальванически
изолированного стимулятора HG 203 (Hi-Med, Англия). Для отведения популяционных
потенциалов использовали электроды с низким сопротивлением. Регистрацию
потенциалов действия или ВПСП проводили, погружая электрод на небольшую глубину
в срезе, соответственно в зону тел пирамидных нейронов (stratum pyramidale) и
зону дендритов (stratum radiatum) (Рис. 2.3).
Схема синаптических входов в различные поля гиппокампа представлена на (Рис.
2.4).
Электрические сигналы, отводимые от срезов мозга, усиливались с помощью
дифференциального усилителя переменного тока с коэффициентом усиления 1000
(Рис. 2.5).
2.3.3 Регистрация вызванных ВПСТ
Для визуализации пирамидных нейронов поля СА1 гиппокампа нами использовался
метод “водоструйного ножа” [241]. Срез гиппокампа прорезали между stratum
pyramidale и stratum oriens тонкой струей
экстраклеточного раствора, который вытекал под давлением из кончика стеклянной
пипетки диаметром 100-200 микрон. После прорезания осторожно удаляли часть
альвеуса, чем обеспечивали свободный доступ к телам пирамидных нейронов,
которые были, в этом случае, хорошо различимы при использовании
инвертированного микроскопа. Клетки гиппокампа являются оптически прозрачными
(при прохождении сквозь клетки интенсивность световой волны меняется
незначительно). В то же время пирамидные нейроны являются фазовоконтрастными
объектами. Для оценки жизнедеятельности клетки была использована
фазово-контрастная оптика (Рис. 2.6).
Препарированные срезы обладали еще одним важным преимуществом: качество
фиксации тока при удалении апикальных дендритов и аксона в нейронах в таких
срезах было существенно лучше, чем в интактных срезах.
Препарированный таким образом срез, переносили в камеру со стеклянным дн