Розділ II.
Матеріали і методи особистих досліджень.
Загальноклінічне обстеження хворих
В стаціонарних умовах обстежено 139 хворих на псоріаз і 20 здорових осіб (група контролю). Клінічне обстеження включало: збирання анамнезу, огляд шкіри і видимих слизових оболонок (колір, тургор, визерунок), оцінку характеру псоріатичних уражень шкіри. Проводили загальні аналізи крові та сечі, калу на яйця глистів, цукор крові та сечі, реакцію Вассермана. Досліджувався стан внутрішніх органів і систем (серцево-судинної, травної, сечо-статевої, дихальної) хворих.
Визначення в крові вмісту продуктів перекисного окислення ліпідів і компонентів антиоксидантної системи.
Забір крові проводили вранці натще із ліктьової вени.
Дослідження компонентів ПОЛ і АОС проводились на базі біохімічного відділу НДЛЦ НМУ ім. О.О. Богомольця*.
Отримання гемолізату.
Для досліджень брали 1,5-2 мл венозної крові з гепарином. Центрофугували (5 хв, 3000 об/хв), відокремлювали плазму від формених елементів крові. Еритроцити відмивали двічі у 10 мл ізотоничного розчину [50]. Потім відмиті еритроцити ущільнювали центрофугуванням (10 хв, 3000 об/хв). Отримані еритроцити гемолізували дистильованою водою (1:5).
________________________________________________________________
*Автор висловлює подяку завідувачу біохімічним відділом НДЛЦ НМУ, кандидату хімічних наук Юрженко Н.М. за практичні поради і допомогу при проведені біохімічних дисертаційних досліджень.
Визначення активності супероксиддисмутази.
Активність СОД виявляли згідно методу [202].Принцип визначення базується на відновленні нітротетразолію синього (НСТ) супероксидними радикалами, які утворюються при реакції між феназинметасульфатом і відновленою формою нікотинаміддінуклеотиду. Утворення нітроформазану, продукту відновлення нітротетразолію, блокується наявністю у пробі СОД, на основі кількості нітроформазану можливо оцінити активність СОД
У кварцеву кювету спектрофотометра вносили:
Інкубаційну суміш 1,50 мл
Гемолізат еритроцитів 0,1 мл
NADH 0,05 мл
К-фосфатний буфер 1,35 мл
В холосту пробу замість гемолізату еритроцитів вносили 0,1 мл дистильованої води.
У контрольній кюветі, яка не вміщувала джерела СОД, проходило більш визначене утворення нітроформазану, ніж у дослідній кюветі, де відновлення НСТ гальмувалось СОД гемолізату.
Процент гальмування утворення нітроформазану під впливом СОД розраховували за формулою:
Ек- Едосл/хв х 100%
Ек/хв
де: Ек - оптична щільність контрольного зразку;
Едосл - оптична щільність дослідного зразку.
За 1 одиницю активності приймали 50% гальмування утворення нітроформазану. Потім проводили перерахунок в одиницях на грам гемоглобіну гемолізату еритроцитів за хвилину.
Визначення активності глутатіонпероксидази
Активність глутатіонпероксидази проводили згідно методу [152], який базується на прямому визначенні швидкості зниження концентрації відновленого глутатіону в реакції з перекисем водню під впливoм ГПО еритроцитів з реактивом Еллмана.
У пробірку вносили: 4,5мл гемолізату еритроцитів; 0,5мл субстратного буферу, вміщуючого 4мМ відновленого глутатіону і 0,4мМ ЕДТА на 0,4М калій-фосфатному буфері з рН 7,0 - 7,2 і 4,5мл води. Інкубували на водяній бані при 37 С 10 хвилин. Після цього в пробірку вносили 0,5 мл 2 мМ Н2О2, швидко змішували і терміново відбирали 2 мл суміші, білок і гемоглобін в якій зразу осаджували 0,2 мл IN сульфосаліцилової кислоти. Залишок продовжували інкубувати при тих же умовах на протязі 10 хвилин. Після цього 2 мл проби обробляли аналогічно першій пробі. Обидві проби центрифугували 15 хвилин при 3000 об/хв. Потім до 0,??мл центрифугату додавали 2,48 мл трис-буферу з рН 8,5 і 0,02мл 10мМ реактиву Еллмана. Паралельно із дослідною пробою готували контроль на реактиви. Через 1 хвилину після додавання реактиву Еллмана на спектрофотометрі заміряли оптичну щільність проти контролю при 412нм. Активність ГПО розраховували за чисельністю втраченого відновленого глутатіону за різницею його вмісту до і після інкубації із застосуванням молярного коефіцієнта екстенції тіонітрофенільного аніону - забарвленого продукту реакції реактиву Еллмана з глутатіоном, рівного 11400 [30]. Результат відображали у ммоль відновленого глутатіону на грам гемоглобіну гемолізату за хвилину.
Визначення активності глутатіонредуктази
Активність глутатіонредуктази визначали за методом [263]. Глутатіонредуктаза каталізує реакцію відновлення окисленого глутатіону. За зменшенням вмісту НАДФН2 в дослідній пробі визначають активність ферменту.
Склад інкубаційного середовища:
Окислений глутатіон 22,5 мкмоль
НАДФН2 18,8 мкмоль
Фосфатний буфер (рН 6.6) 0,2 моль
В кювету спектрофотометра вносили: 2,9мл інкубаційного середовища та вимірюють величину оптичної щільності при =340 нм. Потім додають в кювету 0,1 мл лізату еритроцитів і вимірюють зменшення оптичної щільності протягом 5 хв. Активність глутатіонредуктази визначали у мкмолях НАДФН2/хв 1 грам гемоглобіну.
Визначення загальної пероксидазної активності
Активність пероксидази визначали за методом [257], який полягає у визначенні швидкості утворення забарвленого продукту реакції окислення О-діанизидіна перекисем водню.
В кювету спектрофотометра вносили: 0,1мл 0,01М О-діанизидіна; 0,1мл 0,05М амітріазола; 0,1мл гемолізату крові; 2.6мл 0,5М калій-фосфатного буферу з рН 7,8. Пусковий субстрат - 0,1мл 6мМ Н2О2. Заміряли збільшення оптичної щільності (Е) при 460нм через кожні 30 секунд на протязі 2 хвилин проти буф