ГЛАВА 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Экспериментальные исследования
Для исследования использовались кролики породы Шиншилла, половозрелые самцы, весом от 1,9 до 2,5 кг, содержащиеся на стандартном рационе вивария. Всего было использовано 98 животных.
2.1.1. Способы моделирования экспериментальных катаракт
Животные были разделены на 4 группы: I - контрольная - интактные животные, не подвергавшиеся никаким воздействиям (15 кроликов); II - опытная - животные, которые использовались для воспроизведения модели световой катаракты (52 кролика); III - опытная - животные, у которых воспроизведение световой катаракты осуществлялось на фоне В1-гиповитаминоза (сочетанное воздействие света и антивитамина - окситиамина) (21 кролик); IV - опытная - животные, у которых моделировали состояние гиповитаминоза без светового воздействия (10 кроликов).
Для воспроизведения экспериментальной катаракты нами была использована световая модель, которая воспроизводилась следующим образом: животные помещались в одноярусные клетки с решетчатыми стенками, расположенными вдоль стен квадратной комнаты, стены которой были выкрашены в белый цвет, площадь комнаты 10 м2 [19].
В центре комнаты на высоте 110-120 см от пола, что соответствовало расстоянию от пола 1/2 высоты клетки, размещалась лампа типа ДРВ-750, с помощью которой производили облучение. Во время облучения положение животных в клетках было естественным. Спектральный состав лампы максимально приближался к солнечному свету и составлял: ультрафиолетовая область - 6,3 %, область видимого света - 47,5 %, инфракрасная область - 46,3 %, диапазон длин волн распространялся от 350 нм до 1150 нм, плотность светового потока составляла 30 мВт/см2. Животные облучались по 9 часов в сутки в течение 40 недель.
При воспроизведении световой катаракты на фоне В1-гиповитаминоза животные этой экспериментальной группы на протяжении всего эксперимента получали окситиамин с водой в дозе 1 мг на кг массы тела в сутки.
Группа В1-гиповитаминозных животных на протяжении всего эксперимента получала окситиамин и содержалась в условиях обычного освещения.
Контрольная группа животных содержалась на фоне обычного освещения и вскармливания.
В течение всего эксперимента хрусталики животных исследовались с помощью биомикроскопии с использованием щелевой лампы фирмы "Карл Цейс". Зрачки предварительно расширяли инстилляциями 1-2 капель 1 % раствора атропина. Осмотр проводили перед началом и каждые две недели в течение всего эксперимента до его окончания.
Биомикроскопические изменения в хрусталиках экспериментальных животных были подразделены на 5 стадий, в соответствии с рекомендациями авторов модели световой катаракты [9, 19, 33]:
0 - прозрачный хрусталик, отсутствие субкапсулярных вакуолей, задний шов узкий с четкими границами.
I стадия - наличие единичных или множественных мелких заднекапсулярных вакуолей, отсутствие изменений в других анатомических зонах хрусталика.
II стадия - наличие множественных мелких вакуолей преимущественно в заднекапсулярных слоях хрусталика, а также единичных мелких вакуолей в других анатомических зонах хрусталика, огрубление заднего шва, расширение его границ.
III стадия - наличие множественных разнокалиберных вакуолей в заднекапсулярных слоях, появление единичных крупных вакуолей в других слоях хрусталика, наличие или отсутствие мелких точечных помутнений в области заднего шва.
IV стадия - наличие множественных разнокалиберных вакуолей как в субкапсулярных слоях, так и в других анатомических зонах хрусталика, наличие мелких точечных помутнений в области заднего шва, слабое диффузное помутнение ядра хрусталика.
V стадия - наличие крупных сливных вакуолей в субкапсулярных слоях и множественных разнокалиберных вакуолей в других анатомических зонах хрусталика, сливные мелкоточечные помутнения в области заднего шва, интенсивное диффузное помутнение ядра хрусталика.
2.1.2. Биохимические методы исследования
Экспериментальных животных забивали методом воздушной эмболии. Сразу же после забоя энуклеировали глаза. Забой, энуклеацию и выделение тканей глаза проводили в холодильной камере. Все последующие операции производили при общем и локальном охлаждении [21, 33, 158].
Полученную из ушной вены кролика венозную кровь готовили для исследования следующим образом: 0,5 мл цельной крови центрифугировали в течение 10 минут при 5000 g. Полученные в результате центрифугирования эритроциты отмывали трижды в течение 10 минут при 5000 g. К 0,1 мл отмытых эритроцитов добавляли 0,4 мл физиологического раствора и полученный гемолизат использовали для биохимического исследования.
Активность транскетолазы определяли спектрофотометрически. Принцип метода состоит в том, что при кипячении в кислой среде седогептулоза (конечный продукт реакции) образует оксиэтилурфурол, который в присутствии орцина и ионов трехвалентного железа дает специфическую сине-зеленую окраску с максимумом поглощения при 625 нм. Окраска стабильна в течение многих часов [158].
К 0,5 мл разведенного гемолизата или гомогената хрусталика прибавляют 0,25 мл раствора рибозо-5-фосфата и пробы инкубируют в течение 1 часа при 370С. Реакция осаждается добавлением 0,75 мл 10 % трехуксусной кислоты. С кровью ставят дополнительную пробу, в которую вносят еще 0,1 мл (50 мкг) раствора тиаминдифосфата. Эта проба в конце инкубации осаждается 0,65 мл 10 % трихлоруксусной кислотой. (Активность, определенная в этой пробе, всегда несколько выше, чем в пробе без тиаминдифосфата. Разница, называемая ТДФ-эффектом, отражает наличие апотранскетолазы в гемолизатах, которая не обеспечена коферментом).
Обработанные трихлоруксусной кислотой пробы перемешиваются, центрифугируются и по 0,5 мл центрифугата переносятся в высокие (18-23 см) пробирки с притертыми пробками. В каждую из них сливается по 0,1 мл концентрированной соляной кислоты. Пробирки с пробами закрываются пробками