РОЗДІЛ 2
Матеріали та методи дослідження
Для дослідження зміни динаміки процесу вивільнення катехоламінів від свіжоізольованих хромафінних клітин щура при різних типах стимуляції використовувались наступні методичні підходи:
* Виділення гостроізольованих хромафінних клітин щура;
* Реєстрація за допомогою електрохімічного методу процесу секреції шляхом використання електроду з карбоновим волокном;
* Вимірювання внутрішньоклітинних індукованих кальцієвих транзієнтів за допомогою флуоресцентного методу;
* Статистична обробка отриманих результатів з використання стандартних методів аналізу;
* Теоретичне моделювання динаміки вивільнення, використовуючи стандартні методи математичної фізики.
Для короткочасової стимуляції хромафінних клітин використовувалась розроблена аплікаційна система на основі електричних клапанів (Lee Co. USA), що дозволяла проводити локальну зміну тестуючих розчинів безпосередньо біля поверхні клітини. Швидкість аплікації складала 0.3мл/хв.
Умови хронічної стимуляції клітин досягались додаванням в зовнішньоклітинний розчин деполяризуючого агента (50мМ KCl) або агоністів ацетилхолінових рецепторів. Електрод з карбоновим волокном розташовувався в безпосередній близькості (?1?М) від поверхні досліджуваної клітини, що давало змогу швидко і з великою роздільною здатністю реєструвати динаміку процесу вивільнення із окремих везікул.
2.1. Електрохімічні методи реєстрації процесу вивільнення катехоламінів
2.1.1. Переваги та можливості реєстрації
Електрохімічні методи детектування, основані на окисленні або відновленні специфічних сполук, дають змогу точно та з надзвичайно великою роздільною здатністю реєструвати процес секреції від окремих клітин. У випадку хромафінних клітин електрохімічні методи є більш чутливими, ніж метод вимірювання ємності клітини при детектуванні окремого секреторного кванту [39,203]. Іншими перевагами даного методу є:
* Можливість чіткого вимірювання процесу екзоцитозу без артефактів пов`язаних з супутніми явищами (такими як ендоцитоз);
* Здатність прямого вимірювання продуктів секреції (а не модель-залежних параметрів, таких як ємність клітини);
* Метод є неінвазивним, при цьому відсутні ефекти, пов`язані з діалізом внутрішньоклітинного вмісту (як при петч-клемп експерименті) та не накладаються обмеження на форму клітини.
Більшість секреторних продуктів здатні легко окислюватись. Серед них найбільш інтенсивно дослідженими є норадреналін, адреналін, допамін та серотонін. Похідні цих сполук, а також оксид азоту (NO) [204], аскорбінова кислота теж добре окислюються. Протеїни, що містять в надлишку амінокислоти тирозін, триптофан та цистеїн, здатні, по крайній мірі теоретично, окислюватись [205], але їх кількість під час процесу секреції, звичайно, є досить малою та повільна дифузія цих сполук значно обмежує можливість їх детектування. У випадку інсуліну, окислення цистеїнових дисульфідних містків можна прискорити, використовуючи каталізатор [206]. Більш того, деякі продукти секреції, що не окислюються, можна хімічно або каталітично перетворити в сполуки, що здатні легко окислюватись. Це стосується глюкози [207], ацетилхоліну [208] та глютамату [209]. Однак, поки неясно, чи достатній такий рівень ферментативного перетворення в усіх випадках для точної та коректної реєстрації процесу секреції від окремих клітин.
Вперше продемонстровано можливість вимірювання процесу секреції за допомогою електрохімічних методів від окремої клітини в 1990 році. Стимуляція хромафінних клітин, що секретують катехоламіни, призводила до реєстрації струмів окислення, що тісно пов`язувались з зростанням рівню [Са2+]і [210]. Слід за цим виявлено, що при одночасному детектуванні процесу екзоцитозу за допомогою двох електродів з карбоновими волокнами, розташованими по різні сторони від клітини, струми окислення не були синхронізованими [211]. Це свідчить про те, що обидва електроди реєструють високолокальні явища, та кожний пік струму представляє процес вивільнення катехоламінів із окремої везікули.
2.1.2. Принципи електрохімічного детектування
Електроди, які здатні детектувати легко окислювані продукти секреції, називаються електродами, що мають поляризаційні властивості. Коли такий електрод занурюється в фізіологічний розчин, електричний струм не може легко протікати через поверхню електроду. В самому електроді носіями струму є електрони, тоді як в фізіологічному розчині основними носіями є іони: Na+, K+, Cl- тощо. Поки на поверхні електроду не буде виникати швидкої реакції, що "перетворює" іонний струм в електронний і навпаки (як це відбувається у випадку індиферентних Ag/AgCl електродів, що занурені в фізіологічний розчин), заряд не буде легко проходити через поверхню. Таким чином, коли на такий поляризаційний електрод прикладається певна напруга, надлишковий заряд, що накопичується на поверхні, буде компенсувати електроактивність електроду. Звичайно, для електронейтральності цей надлишковий заряд повинний збалансовуватись рівним зарядом протилежного знаку зі сторони розчину. Мобільні іони протилежного знаку будуть електростатично притягуватись до поверхні, вистроюючись в лінію, і формуючи, таким чином, "подвійний заряджений шар". Електронейтральність досягається лише на певній відстані, на якій затухає електричне поле. Ця просторова константа називається довжиною Дебая і складає приблизно 9А? для фізіологічного розчину. При такій рівновазі може виникати незначний загальний струм. Однак, коли молекули, що легко окислюються (або відновлюються), дифундують до поверхні електроду, виникає хімічна реакція (рис. 2.1) і утворені в результаті електрони переходять через поверхню, викликаючи електричний струм.
Рис. 2.1. Реакція окислення молекули адреналіну на поверхні електроду за умови прикладання на нього певної напруги.
При будь-якій фіксованій напрузі встановлюється динамічна рівновага між поверхнею електроду та окисленими формами хімічно активних речових в розчині. Їх кількіс