РОЗДІЛ 2
ОСНОВНІ МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Матеріали та реактиви
В роботі використовували фенілметилсульфонілфторид (ФМСФ) фірми "Calbiochem" (Швейцарія), 2-меркаптетанол фірми "Merk", (ФРН), додецилсульфат натрію (ДСNa), персульфат амонію фірми "Bio-Rad", (США), дитіотритол фірми (ДТТ)"Fluka" (Швейцарія), трис фірм "Sigma", "Calbiochem", "Serva", (ФРН), N,N-метиленбісакріламід, гліцерин, Кумасі блакитний R-250 та G-250, акриламід фірми "Serva"(ФРН) та "Bio-Rad" (США); кумарову кислоту і люмінол фірми "Sigma" (США); етиленгліколь-біс (2-аміноетиловий ефір)- N,N,N',N' - тетраоцтової кислоти (ЕГТА), етилендіамінтетраацетат (ЕДТА), твін - 20 і тритон X-100 були фірм "Serva" (ФРН) та "Fluka" (Швейцарія); тетраметилбензидин 2,2'- азидо- ді(3-етил) бензотіазолін-сульфонову кислоту (АБТС) фірми "Sigma" (США); N,N,N/,N/ -тетраетилендіамін (TEMEД) фірм "Bio-Rad" (США) та " Ferak" (ФРН); бромфеноловий синій фірми "Bio-Rad" (США); нітроцелюлозні фільтри фірми "Millipore" (США); рентгенівську плівку фірм "Свема" (Україна), "Тасма" (Росія), "Kodak" (США); кон?югат білок А - пероксидаза -фірм "Sigma" (США) та "ДіаПрофМед" (Україна); планшети для імуноферментного аналізу фірм "Nunk" (Данія) та "Sorsted" (ФРН); малахітовий зелений фірми "Bio-Rad" (США).
Реактиви NH4Cl, KCl, NaCl, LiCl, KH2PO4, пірофосфат натрію були вітчизняного виробництва, кваліфікації ос.ч. Реактиви KH2PO4, K2HPO4, Na2HPO4, NaH2PO4, KHCO3, NaHCO3, Na2CO3, K2CO3, NaOH, KOH, C2H5OH, метол, гідрохінон, гіпосульфіт натрію, борна кислота, лимонна кислота, желатина, знежирене сухе молоко, НСl, H3PO4, трихлороцтова кислота, оцтова кислота, гліцерин були вітчизняного виробництва кваліфікації ч.д.а. та х.ч.
Патологоанатомічний аутопсійний матеріал (секції лівих шлуночків міокарда) осіб, які померли внаслідок ДКМП та ішемічної кардіоміопатії (ІКМП), були люб'язно надані відділенням патоморфології Інституту кардіології ім. М.Д. Стражеска АМН України (керівник відділення - д.мед.н., професор Гавриш О.С.). Дозвіл на отримання патологоанатомічного матеріалу було схвалено етичною комісією Інституту. Після забору матеріал одразу заморожували у рідкому азоті та зберігали при температурі - 70 0С до використання.
Поліклональні антитіла проти рекомбінантного білка DnaK (прокаріотичний гомолог Hsp70) були надані др. Я. Бріксом (лабораторія проф. Н.Пфаннера, Інститут біохімії і молекулярної біології, Фрайбург, Німеччина).
Сироватки пацієнтів надано відділенням серцевої недостатності Інституту кардіології ім. М.Д. Стражеска АМН України (керівник відділення -д.мед.н., професор Воронков Л.Г.), де хворі проходили клінічне обстеження і лікування.
У роботі використовували сироватки крові 21 здорового донора та 96 хворих. До складу пацієнтів входили 62 хворих на ДКМП та 34 хворих на ІКМП. Діагноз ДКМП встановлювали на основі клінічних ознак, даних електрокардіографії, рентгенологічного, ехокардіографічного та лабораторних методів обстеження у відповідності з рекомендаціями ВООЗ [5]. У 19 хворих на ДКМП діагностували ?? Б, а у 43 хворих - ?? А стадію хронічної серцевої недостатності. До групи хворих на ІКМП входили особи, у яких хронічна серцева недостатність розвинулася в результаті гіпертонічної хвороби, а у 7 з них - в результаті гіпертонічної хвороби та перенесеного інфаркту міокарда. Хворі обох груп були порівнянні по більшості вихідних клініко-функціональних показників. Деякі вихідні показники у групах хворих на ДКМП та на ІКМП, а також у групі здорових донорів наведено у табл.2.1.
Для отримання сироватки кров інкубували протягом однієї години в термостаті при температурі +37оС. Після цього кров центрифугували 15 хвилин при 1500 - 2000 g і температурі +4 оС. Надосад являв собою сироватку крові. Його відбирали, додавали рівний об'єм гліцерину і зберігали при температурі -20оС. При потребі сироватку крові висолювали сульфатом амонію з метою осадження імуноглобулінів.
Таблиця 2.1
Вік, стать та показники функціонування серцевого м'язу у хворих на ДКМП, ІКМП та у здорових донорів
ГрупаКіль-кість обсте-женихВік (роки)Стать (ч/ж)Кінцевий
діастолічний
об'єм, млКінцевий систолічний об'єм, млФракція викиду, %Хворі на ДКМП6244,9 + 1,559/3290,07 + 8,13189,82 + 6,4834,30 ? 0,86Хворі на ІКМП3451,3 + 2,130/4293,35 + 11,15191,24 + 9,99 35,77 ? 1,32Здорові донори2148,8 + 4,514/7145,46 + 2,19 61,65 + 1,5357,62 + 0,68
2.2. Виділення ТМ з міокарда людини
ТМ виділяли із міокарда пацієнта, який загинув від ДКМП, та із міокарда практично здорової людини, яка загинула внаслідок нещасного випадку, за методом [114] з модифікаціями (рис.2.1). В результаті наших модифікацій, по-перше, було зменшено кількість промивок м'язового фаршу, по-друге, у кожний розчин додавали інгібітор протеаз ФМСФ у концентрації 0,2 мМ, що значно підвищило вихід, чистоту і активність одержаних препаратів. Усі операції проводили на холоді. Шматочок міокарда подрібнювали ножицями та промивали до світло-жовтого кольору у боратному буфері (40мМ Н3ВО3; 0,1 М КСl; 0,2 мМ ФМСФ). Тканину гомогенізували у буфері для екстракції міозину (0,3 М КСl; 0,15 M K2HPO4, pH-6,8; 0,01 M Na2 HPO4; 1мM MgCl2; 0,2 мM ФМСФ) у гомогенаторі Поттера. Залишали для екстракції на 35-40 хвилин. Після екстракції міозину та центрифугування (6000g, 30 хвилин) осад заливали трьома об'ємами дистильованої охолодженої води і залишали на 30 хвилин. Осад збирали центрифугуванням при 6000g (30 хвилин), потім заливали двома об'ємами охолодженої дистильованої води. Осад збирали центрифугуванням (6000g, 15-20 хвилин). Отриманий осад змішували з етанолом (1:1, v/v). Через 30 хвилин осаджували центрифугуванням при 6000 g. Наступним етапом була обробка осаду ефіром. Для цього осад заливали ефіром (1:1, v/v), витримували 30 хвилин та відділяли центрифугуванням (6000g, 15-20 хвилин).
Відмивка міофібрил з м'язового фаршу
Екстракція міозину розчином високої іонної сили
Обробка осаду етанолом і ефіром
Екстракція ТМ 1 М KC