РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Умови та програма проведення досліджень
Дослідження проводили на безпородних білих щурах-самцях масою 100-120 г, які утримувались в старнартних умовах віварію відповідно до Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних і наукових цілей (Страсбург, 1986). Тварин розділяли на 3 групи: "контроль", "діабет", "діабет + нікотинамід", декапітували під ефірним наркозом. Експериментальний ЦД викликали одноразовим введенням стрептозотоцину фірми "Sigma" в розрахунку 7 мг на 100 г маси, внутрішньочеревно. У дослід брали тварин через два тижні після індукції діабету з рівнем глюкози в крові 10-15 мМ. Терапевтичний ефект нікотинаміду (препарат фірми "Sigma") досліджували за його внутрішньом'язевого введення у дозі 200 мг на 1 кг маси щоденно протягом 14 днів щурам з розвиненою гіперглікемією.
Експериментальні дослідження включали такі основні етапи:
1) Дослідження еритропоезу за умов експериментального стрептозотоцинового діабету та введення нікотинаміду, яке включало визначення вмісту креатину в еритроцитах, морфологічні дослідження клітин ЕР кісткового мозку, оцінку кислотної резистентності еритроцитів периферійної крові та рівень ретикулоцитів у ній.
2) Оцінка процесів ПОЛ у разі визначення дієнових кон'югатів і ТБК-активних продуктів та дослідження антиоксидантної системи у разі визначення рівня відновленого глутатіону, СОД, каталазної, ГР, ГПО, Г-6-ФДГ активності в клітинах кісткового мозку й еритроцитах периферійної крові.
3) Вивчення нітритредуктазної ланки утворення оксиду азоту за участю дезоксигемоглобіну у разі її визначення у вакуумованих гемолізатах. Дослідження нітрозилювання дезоксигемоглобіну в експериментах in vitro у разі реєстрації електронних адсорбційних спектрів.
2.2. Отримання клітин кісткового мозку
Принцип методу грунтується на розділенні клітин КМ у тришаровому градієнті густини фіколу та суміші фіколу з рентгеноконтрастним препаратом - верографіном (d1=1,03 г/cм3, d2=1,09 г/cм3, d3=1,1 г/cм3). За допомогою цього прийому вдається одночасно розділити суспензію клітин кісткового мозку на 3 фракції: клітини лімфоїдного ряду; клітини еритроїдного ряду та клітини гранулоцитарно-моноцитарного ряду [110].
Кістковий мозок отримували з великих стегнових кісток щурів. Кровотворна тканина ресуспендується через нейлонове полотно. Отриману в такий спосіб суспензію клітин кісткового мозку двічі промивали фізіологічним розчином по 5 хв за 600g.
Градієнт густини готували почерговим нашаровуванням розчинів: d1=1,1 г/cм3, d2=1,09 г/cм3, d3=1,03 г/cм3 по 3 мл кожного. Клітинну суспензію наносили зверху в об'ємі 1 мл. Центрифугували 10 хв за 500 g.
За допомогою шприца з довгою голкою фракції відбирали в окремі пробірки і відмивали від фіколу і верографіну охолодженим фізрозчином.
2.3. Морфологічні дослідження клітинних елементів крові та кісткового мозку
2.3.1. Приготування цитологічних препаратів клітин кісткового мозку. Для отримання цитологічних препаратів клітин кісткового мозку застосовували комбіноване фарбування Май-Грюнвальда-Романовського-Гимзи за Папенгеймом [111].
Мазок робили шліфованим склом поставленим під кутом 45? до предметного скла, яке перед тим ретельно обезжирювали. На нефіксований мазок наносили 2 мл готового розчину фарби - фіксатора Май-Грюнвальда, який є розчином еозину та метиленового синього в метиловому спирті. Через 3 хв до фарби, яка покриває мазок, додавали однакову кількість дистильованої води та старанно перемішували фарбу на мазку. Коли мазок набув рожевого відтінку, барвник з мазка зливали і не висушений дофарбовували свіжоприготованим водним розчином фарби Романовського (1 крапля фарби на 1 мл Н2О) 8-15 хв. Згодом фарбу зливали, а мазок промивали.
Клітини еритроїдного ряду КМ (не менше 500) у мазку підраховували підряд у декількох ділянках мазка й обчислювали процентний вміст кожного виду клітин.
2.3.2. Визначення вмісту ретикулоцитів. Визначення вмісту ретикулоцитів проводили за модифікованими методиками Л. Гейльмейєра та Зінгера [111].
Принцип методу полягає в тому, що зернисто-сітчасто-нитчасту субстанцію молодих еритроцитів видно лише у випадку прижиттєвого фарбування, тобто без висушування та фіксації.
0,08 мл 1% розчину крезилового синього блискучого на ізотонічному фізіологічному розчині набирали в пробірку. До барвника додавали 0,02 мл цільної крові. Через годину робили тонкий мазок цієї суміші на предметному склі. Після висихання мазок фіксували етиловим спиртом протягом 5-10 хв, а потім дофарбовували за Романовським-Гимзою протягом 45-60 хв. Ретикулоцити підраховували на 1000 еритроцитів, результати виражали у відсотках.
2.4. Метод встановлення кислотної резистентності еритроцитів
Принцип методу грунтується на тому, що при 630 нм (червоний світофільтр) практично не спостерігається зміна кольору Hb, тому екстинкція залежить лише від концентрації завислих у розчині клітинних елементів [121].
Роботу проводили у термостатованій кюветі за 24? С. Кров змішували з фізрозчином до отримання екстинкції 0,700 при 630 нм. У кювету вносили 1,5 мл робочого завису еритроцитів і додавали однаковий об'єм 0,004 н розчину HCl у 0,85% NaCl. Чітко через 30 с і потім кожні 30 с визначали екстинкцію протягом 7 хв. Контролем слугувала дистильована вода.
Зменшення екстинкції зумовлене поступовим руйнуванням еритроцитів. Воно відображає почерговість залучення до гемолізу еритроцитів, зі зростаючою стійкістю, що дає змогу їх розрізнити.
2.5. Виявлення ферментативної активності
2.5.1. Визначення супероксиддисмутазної активності. Принцип визначення базується на реакції відновлення нітротетразолію супероксидними радикалами, що утворюються при взаємодії феназинметасульфату з NADН. Утворення нітроформазану - продукту відновлення нітротетразолію синього блокується наявністю у пробі СОД, тому за кількістю утворення н