РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Матеріали та обладнання
В роботі використовували: центрифуги “MSE Hight Speed 18”, “Backman L-5”,
“Eppendorff 5447R”, „Microspin 24S DuPont”, рН-метр “Hanna”, денситометр
"Anthos2001", прилад для напівсухого електропереносу “Trans Blot SD” фірми Bio
Rad та інші.
Використовували бензамін, леупептин, апротинін – “Amarsham”, США,
2-меркаптоетанол, деоксихолат натрію – “Merck”, ФРН; ФМСФ – “Calbiochem”,
Швейцарія; додецилсульфат натрію, персульфат амонію – “Bio-Rad”, США; трис
“Sigma”, США, кумасі діамантовий голубий R-250 та G-250, акриламід, ЕДТА,
TEMED, DMSO, DDT, – “Serva”, США; Tween 20, метиленбісакриламід, етидій бромід
– “Sigma”, США.
Користували також HCl, KOH, CH3COOH, KCl, NaCl, NaH2PO4, KH2PO4, СаСl2, MgCl2,
етанолом, бромфеноловим синім, гліцином, амінооцтовою кислотою вітчизняного
виробництва, кваліфікації о.с.ч.
Середовища для культивування еукаріотичних клітинних ліній виробництва
Invitrogen (США); інсуліноподібний ростовий фактор (IGF), епідермальний
ростовий фактор (EGF), дефосфо-КоА, фосфатидилхолін, фосфатидилсерин,
фосфатидилетаноламін, фосфатидилінозитол виробництва “Sigma”, США;
мітохондріальний маркер MitoTracker Orange виробництва “Мolecular Probes”,
США.
2.2. Плазміди, штами та клітинні лінії
Плазміди, що використовували у скринінгу методом дріжджової двогібридної
системи.
Репортерні плазміди: pSH18-34 (містить 8 операторних послідовностей для LexA),
pJK103 (містить 2 операторні послідовностей для LexA), pRB1840 (містить 1
операторну послідовність для LexA), pJK101 (ген lacZ знаходиться під контролем
2-х LexA операторних послідовностей, використовується для визначення
зв’язування bait до операторних послідовностей).
Тестові/контрольні плазміди: pSH17-4 (активаційний домен GAL4 клонований в
pEG202 використовується позитивний контроль для транскрипційної активації),
pEG202-Max (експресує LexA-Max злитий білок і використовується як негативний
контроль для тестування позитивних клонів), pBait (конститутивно експресує
LexA-bait, що специфічно взаємодіє з білком, що експресує pTarget), pTarget
(експресує В42-target білок, що специфічно взаємодіє з білком pBait),
Вектори для "bait"- конструкцій: рEG202 (містить ДНК послідовність, що кодує
LexA за якою іде полілінкер для клонування «bait» білка), рEG202-NLS
(аналогічний рEG202, але містить кодуючу послідовність для сигналу ядерної
локалізації між LexA та «bait» білком), pNLexA (LexA розташований не перед, а
після “bait” білка).
Вектор для "prey"-конструкцій: pJG4-5 (індуцибельний галактозою GAL4 промотор
експресує B42-HA таг після якого іде полілінкер для клонування кДНК
бібліотек).
Плазміда для експресії рекомбінантних білків у клітинах E.coli - pET23d
(Novagen, США).
Плазміда для експресії в клітинах ссавців - pcDNA3.1(+) (Invitrogen, США).
Штами Saccharomyces cerevisiae, що використовували у скринінгу методом
дріжджової двогібридної системи :
EGY48 Генотип MAT alpha, his3, trp1, ura3,6LexAop-LEU2,
EGY194 Генотип MAT alpha, his3, trp1, ura3,4LexAop-LEU2,
EGY188 Генотип MAT alpha, his3, trp1, ura3,2LexAop-LEU2,
EGY40 Генотип MAT alpha, his3, trp1, ura3,1LexAop-LEU2,
RFY206 Генотип MATa, trp1, his3, ura3, leu2, lys2;
Escherichia colі штами:
КС8. Генотип: hsdR, leuB600, trpC9830, pyrF::Tn5, hisB463, lacDX74, strA,
galU,K
XL-1 Blue. Генотип: supE44 hsdRIT recAl endAl gyrA46 thi relAl
lac-F[proAB+lacI9 lacZAM15 TnlO(tef)].
BL21(DE3)pLysS. Генотип: F" ompT hsdSs (rb- mb-) gal dsm (DE3) pLysS (CamR).
Штам DE3 містить DE3 лізоген, під контролем T7 РНК полімерази acUV5 промотора.
IPTG є необхідним для індукування експресії T7 РНК полімерази.
Еукаріотичні клітинні лінії: MCF-7 (карцинома молочної залози людини), HEK293
(клітини ембріональної нирки людини), NIH3T3 (клітини фібробластів миші),
MDA-MB-453 (клітини аденокарциноми молочної залози людини), T47D (клітини
карциноми молочної залози людини), C3.6 (клітини раку мозку щура), MDCK
(клітини епітелію нирок собаки), Rajl (клітини лімфоми Буркіта людини), Colo320
(клітини аденокарциноми прямої кишки людини), U937 (клітини гістоцитичної
лімфоми людини), CHO-IR (клітини яєчника китайського хом’ячка), J774 ( клітини
макрофаги-моноцити миші).
2.3. Двогібридна система дріжджів
Двогібридна система дріжджів [134-136] є генетичним методом в якому активація
транскрипції репортерних генів використовується для детекції білок-білкових
взаємодій. Принцип системи базується на модульній структурній організації
сайт-специфічних транскрипційних активаторів, що складаються з
ДНК-зв’язувального та активаційного доменів, структурно рознесених у просторі
[137-139]. ДНК- зв’язувальний домен забезпечує взаємодію активатора
транскрипції зі специфічними регуляторними ділянками гена. Асоціація ж
активаційного домену із іншими білками (факторами транскрипції) призводить до
ініціації транскрипції відповідного гена. Фізичний контакт між доменами є
необхідною умовою функціонування активатора транскрипції однак він може
утворюватись не лише за рахунок ковалентних зв’язків між доменами (як це існує
у ендогенного ензиму). Двогібридна система передбачає можливість утворення
контакту між окремими доменами активатора транскрипції за рахунок
білок-білкової взаємодії між білками або фрагментами білків, що досліджуються,
злитими з відповідними доменами активатора транскрипції. Це, в свою чергу
відновлює повну структуру активатора транскрипції і, відповідно, активацію
транскрипції репортерного гена. Таким чином, використання системи передбачає з
одного боку ст
- Київ+380960830922