Ви є тут

Особливості експресії альфа та бета ізоформ протеїнкінази рибосомного білка S6 при злоякісній трансформації в тканинах молочної залози людини

Автор: 
Савінська Лілія Олексіївна
Тип роботи: 
Дис. канд. наук
Рік: 
2005
Артикул:
0405U000058
129 грн
Додати в кошик

Вміст

Розділ 2
Матеріали та методи досліджень
2.1. Матеріали та реактиви
Солі, кислоти та основи використовували марки “осч” або “чда” вітчизняного
(”Реахим”) та зарубіжного виробництва (Sigma, Pharmacia, Fluka). Буферні
системи та розчини готували на воді надвисокої очистки, звільнену від
органічних та неорганічних домішок, отриману з використанням сертифікованої
системи очистки води виробництва Barnstead/Thermolyne (CША). Контроль за рівнем
рН здійснювали за допомогою сертифікованої цифрової вимірювальної системи
точністю до 0,01 рН Hanna Instruments 8521 (Португалія). Рідкі та агаризовані
середовища для живлення бактерій готували з сухих сумішей зарубіжного
виробництва (Helena BioSciences, Sigma).
Всі операції, пов’язані з приготуванням, зберіганням та транспортом хімічних
речовин і розчинів здійснювали з використанням високочистого пластикового та
скляного посуду, сертифікованого для роботи в біологічній лабораторії, кінчиків
для піпеток одноразового використання, одноразових гумових рукавичок та
автоматичних піпеток фірми Gilson (Франція).
2.2. Зразки тканин
2.2.1. Нормальні та пухлинні тканини молочної залози людини. Післяопераційні
зразки тканин молочної залози були люб’язно надані співробітниками кафедри
онкології Національного медичного університету імені акад. Богомольця О.О. МОЗ
України та Київської міської онкологічної лікарні. Для досліджень відбирали
пухлини аденокарциноми молочної залози та прилеглі позапухлинні тканини
пацієнтів, що не зазнавали дії попередньої променевої та хімічної терапії.
Матеріал добирали від хворих на І та ІІ стадіях перебігу хвороби. Переважна
більшість доброякісних пухлин видалялись на стадії їх швидкого росту. При
секторальній резекції відбирали також ділянки навколопухлинних тканин, які не
містили гістологічно змінених осередків, та залучали до проведення досліджень
як умовну норму. Діагнози та клінічні показники були верифіковані гістологічно
у патоморфологічній лабораторії означеної лікарні. Досліджували 55 злоякісних
пухлин (аденокарциноми), 24 доброякісних (20 фіброаденом, 1 фіброаденоматоз, 1
фіброліпома та 2 кісти) та 19 зразків тканин, що оточували злоякісні та
доброякісні пухлини (5 та 14 зразків відповідно). Зразки нормальних та
пухлинних тканин заморожували в рідкому азоті та зберігали при –70оС.
2.2.2.Тканини ссавців. Аналіз експресії S6Ka та b ізоформ в нормальних тканинах
ссавців проводили на безпородних білих щурах, самцях та самках, віком від 2,5
до 4 місяців. Після декапітації тварин, щойно отримані органи промивали
холодним ЗФР, заморожували в рідкому азоті та зберігали при –70оС.
2.3. Отримання рекомбінантних фрагментів білків S6К
2.3.1. Ампліфікування кДНК для С-кінцевих фрагментів S6б та b. Фрагмент кДНК
(рис.2.1.А), який кодує С-кінцеву амінокислотну послідовність (453-525) р70S6Кб
було ампліфіковано з повнорозмірної кДНК щура, клонованої у векторі рсDNA3.1
методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) з використанням ДНК-полімерази
Pfu Turbo (Stratagene) за стандартним протоколом на ампліфікаторі Eppendorf
(Німеччина). Ефективність ампліфікації перевіряли електрофорезом в 1%
агарозному гелі, який містив 0,01% бромистого етидію. Візуалізацію ДНК
проводили в УФ-випромінюванні.
Як 5`-праймер у ПЛР було використано олігонуклеотидну послідовність
1-АТТССАТGGАGСАССАССАССАССАССАСGGGGАТТТСТGGGGААGАG
GTG-51, яка містила сайт рестрикції ендонуклеази NсоI (нуклеотидні залишки 4-9)
і безпосередньо за ініціюючим метіоніном мала послідовність, що кодує шість
гістидинів (нуклеотидні залишки 12-30). Усі використані в роботі праймери були
виробництва фірми Amersham, Велика Британія. 3`-праймер:
1-СGGGААТТСТАGАТТСАТАСGСАGGТG-30, містив сайт упізнавання рестриктази ЕсоRI
(нуклеотидни залишки 4-9).
кДНК, яка кодує амінокислотну послідовність 442-495 для С-кінцевого фрагмента
S6Кb (рис. 2.1.Б), ампліфікували ПЛР, використовуючи повнорозмірну кДНК S6Кb
людини, отриману з Uni-Zap бібліотеки кДНК клітин лінії НЕК293. Як 5`-праймер
було використано олігонуклеотидну послідовність
ATTCCATGGAGCACCACCACCACCACCACTTTGAGGGGTTTСGGCCCAGC, яка містила сайт рестрикції
ендонуклеази NсоI (нуклеотидні залишки 4-9) і безпосередньо за ініціюючим
метионіном мала послідовність, що кодує шість гістидинів (нуклеотидні залишки
12-30). 3’-праймер: CGGGAATTCCTAGCGCCCTGGACGCCCACG містив сайт для рестриктази
EcoRI (нуклеотидні залишки 4-9).
2.3.2. Клонування кДНК С-кінцевих фрагментів S6К у експресувальні плазміди.
Амплифіковані кДНК С-кінцевих фрагментів S6Кб та b було клоновано в плазмідний
експресувальний вектор рЕТ23d (“Novagene”, США) за NсоI/EcoRI сайтами,
відповідно. Нуклеотидну послідовність клонованих фрагментів визначали за
стандартним протоколом з використанням автоматичного секвенатора “АВІ 377”
(Велика Британія). Бактеріальні клітини ВL 21DЕЗ (Stratagene, США) були
трансформовані експресувальним вектором з клонованою кДНК. Для цього 5х109
компетентних клітин інкубували на льоду протягом 15 хв з 0,01 мкг плазмідної
ДНК із застосуванням температурного шоку (інкубація протягом 2 хв при 420 С).
Трансформовані бактерії висівали на чашки Петрі, вкриті LB-агаром (Helena
BioScieces), який містив 0,01% ампіциліну для селективного відбору позитивних
клонів клітин, трансформованих рекомбінантним вектором, що містив ген
резистентності до ампіциліну.
2.3.3. Експресія у бактеріях та виділення С-кінцевих фрагментів S6 кінази б та
b. Індукцію експресії С-кінцевих пептидів р70S6-кінази здійснювали 1 мМ IPTG
протягом 4 год при 30°С в культурі трансформованих бактерій, які знаходились у
логарифмічній фазі росту у середов